Laboratorio 3 “ Cuantificación colorimétrica de proteínas”

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Laboratorio 3

“ Cuantificación colorimétrica de proteínas”

Integrantes: Fernando Alfaro

                    Rodrigo Gazman

                    Catalina González

Sección: 1

Docente: Héctor Araya

15 de Enero de 2018

INTRODUCCIÓN

La espectrofotometría es un método de análisis de concentración de un reactivo o producto durante una reacción o también una medida de la cantidad de energía absorbida por las moléculas de una muestra en función de longitudes de ondas específicas. [1]

Otro método de medición es el reactivo de Biuret, la cual se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la unión entre Cu+2 y los pares de electrones no apareados del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos de las proteínas. [2]

Las proteínas son importantes dentro del organismo, ya que tienen funciones como de defensa, catalizadores, hormonal, estructural, entre otras. Por lo que es relevante su concentración en el cuerpo humano para el control de la homeostasis. En el siguiente práctico se establecerán las concentraciones de distintos tipos de proteínas más tres muestras problema, utilizando los métodos de medición mencionados anteriormente.

OBJETIVOS

• Aprender el uso de la espectrofotometría en la determinación de concentración de soluciones.
• Conocer la Ley de Lambert-Beer y la relación con la espectrofotometría.
• Conocer el funcionamiento del reactivo de Biuret.
• Determinar las concentraciones de muestras problemas y algunas proteínas.
• Realizar una curva de calibración con los resultados obtenidos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Al inicio del laboratorio se rotularon tubos del 1 al 9. En el tubo N°1 se vertieron 2 mL de NaCl 0,9% p/v, en el tubo N°2 se colocaron 1,8 mL de NaCl 0,9% p/v y 0,2 mL de SAB 5 mg/mL, en el tubo N°3 se ingresaron 1,5 mL de NaCl 0,9 % p/v y 0,5 ml de SAB 5 mg/mL, en el tubo Nº4 se introdujeron 1 mL de NaCl 0,9 % p/v y 1 mL de SAB 5 mg/mL, en el tubo Nº5 se depositaron 0,5 mL de NaCl 0,9% p/v y 1,5 mL de SAB 5 mg/mL, por último, en el tubo Nº6 se vertieron 2 mL de SAB 5 mg/mL. La herramienta utilizada para introducir las soluciones en los tubos de ensayo fue la micropipeta p1000 con puntas desechables.

A continuación con los siguientes 3 tubos se utilizó distintas soluciones, en el tubo Nº7 se ingresaron 2 mL de leche descremada (1:8), en el tubo Nº8 se depositaron 2 mL de leche descremada (1:16) y finalmente en el tubo Nº9 se introdujeron 2 mL de orina.

Luego se depositó a cada muestra o tubo 2 mL de Reactivo de Biuret. Una vez introducido este reactivo se ingresó los 9 tubos en una incubadora a 50°C durante 5 minutos.

Cuando trascurrió los 5 minutos, se retiraron los tubos de la incubadora para ser depositados en cubetas de plásticos previamente limpiadas.

Para poder determinar la concentración de proteínas de cada una de las muestras, se depositó las cubetas de plástico en un espectrofotómetro UV visible. Con el fin de obtener resultados correctos, tuvo que calibrarse el espectrofotómetro previamente para dejarlo en valores de 100%. Una vez realizado este proceso, se colocaron de a 4 las cubetas de plásticos en el espectrofotómetro para poder calcular de manera precisa el valor de la absorbencia.

RESULTADOS

Los  resultados de absorbancia que se obtuvieron en el laboratorio con respecto al tubo Nº 1 fue un valor de 0,  el tubo Nº2 fue 0.084, el tubo Nº 3 fue 0.163, el tubo Nº 4 fue 0.339, el tubo Nº5 fue 0.500, el tubo Nº 6 fue 0.678, el tubo Nº 7 fue 0.469, el tubo Nº 8 fue 0.266 y el tubo Nº 9 fue de 0.056. ( Tabla 1, Ver Anexo).

Con los resultados obtenidos se realizó un gráfico de calibración. ( Grafico 1, Ver Anexo) (Cálculos, Ver Anexo)

En el tubo Nº 1 y 9 se observa una coloración azul, lo que refleja la ausencia de proteína, mientras que en los tubos 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 presento un color violeta lo que esclarifica la presencia de proteínas.( Tabla 2 con imagen, Ver Anexo).

DISCUSIÓN

El reactivo de Biuret es un método para detectar la presencia de proteínas en una solución, pueden ser péptidos cortos o con más de dos enlaces peptídicos en sustancias desconocidas. Este reactivo está compuesto de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4). En soluciones alcalinas, el Cu+2 se une a los enlaces peptídicos, dando el color morado, es decir, positivo en la detección de proteínas en la solución. La cantidad de color producido es proporcional a la concentración de proteínas. Esta prueba sirve para la identificación de tripéptidos en adelante. [4]

El tubo Nº1 solo contenía NaCl al 0.9% con 200 mL de solución, esta solución presento un color azul, es decir, dio un resultado negativo en base al reactivo de Biuret, ya que la disolución no contenía proteínas en su composición, sino que poseía sulfato de cobre, lo que dio una tonalidad azul.

En los tubos Nº2, Nº3, Nº4, Nº5 y Nº6 la coloración de estas muestras arrojaron el color violeta, es decir, un resultado positivo, ya que en su composición propiamente tal contenía SAB (“La albúmina sérica (SAB) es uno de los componentes del plasma sanguíneo. Se trata de una proteína fabricada por el hígado que juega un papel importante en el transporte de los líquidos en los vasos sanguíneos y su reparto entre los tejidos y los vasos”) [3] 5 mg/mL y esta solución en su composición poseía aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano (Imagen 1, Ver Anexo) lo cual le da a las proteínas su característico espectro de absorción ultravioleta (UV) a 280 nm. En las soluciones de cada tubos, se observó un complejo coloreado, racionando los grupos amino con el Cu+2 dado que se ocupó CuSO4  en un medio básico donde se ioniza el Cu como Cu+2, lo que produce que se forme un complejo de coordinación del cobre con los nitrógenos de los enlaces peptídicos, logrando observarse el color violeta.

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