Citometria De Flujo
Enviado por madchemist • 25 de Septiembre de 2011 • 4.269 Palabras (18 Páginas) • 507 Visitas
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
Citometría de flujo: Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Milena Salgado Lynn
Curso de Métodos en Biotecnología
Semestre 2002-2
Coordinador: Dr. Roberto Stock
27 de mayo de 2002
2
Índice
Página
Introducción 3
Historia del Instrumento 5
Descripción y funciones de los componentes del aparato
Sistema de Flujo 7
Sistema Óptico 7
Sistema Eléctrico 8
Obtención de los datos e interpretación 10
Aplicaciones 12
Bibliografía 18
3
Introducción
Actualmente, la mayoría de las preguntas en el campo de la biología celular se enfocan en
saber qué es lo que sucede con las células integrantes de un sistema, cómo son las
interacciones dentro del mismo y, sobre todo, cuáles son las propiedades individuales de
cada una. Estas preguntas han llevado a la necesidad de aislar y/o purificar
subpoblaciones y subcomponentes celulares, generalmente para (1) enriquecer poblaciones o
para (2) eliminarlas. Para alcanzar estos objetivos, el primer paso en el proceso de
aislamiento es la identificación y clasificación de las células. La clasificación de las
células puede basarse en propiedades fisicoquímicas, inmunológicas y funcionales. Los
métodos de clasificación que se basan en propiedades funcionales utilizan características
tales como afinidad, adherencia o crecimiento. La clasificación inmunológica se basa en la
utilización de anticuerpos dirigidos contra epítopes celulares. En la práctica, las
características fisicoquímicas son las más utilizadas para la separación o “sorteo celular”;
se incluyen características como tamaño, volumen, densidad, propiedades de dispersión de
la luz, potencial de membrana, pH, carga eléctrica y contenido celular de diferentes
compuestos como ácidos nucléicos, enzimas y otras proteínas (Orfao, et.al.; 1996).
En los últimos años ha habido un incremento en las técnicas que utilizan más de una
característica celular para clasificar y separar diferentes subconjuntos celulares y
componentes subcelulares. Estas técnicas pueden agruparse básicamente en (a) separación
gruesa y (b) separación de células individuales. La separación gruesa se refiere a métodos
tales como la filtración celular, la centrifugación o sedimentación y el cultivo celular. La
separación de células individuales se refiere principalmente a la citometría de flujo que,
enriquecida con el “sorteo celular”, es la mejor técnica para proveer información en cuanto al
análisis y separación de poblaciones celulares.
La citometría de flujo es un proceso que permite que las células (500 – 4000/ seg) pasen en
fila dentro de un flujo a través del aparato (Beckton Dickinson Immunocytometry
Systems; 1995). Mientras esto sucede, se puede hacer la medición simultánea de múltiples
características físicas de una sóla célula. La ventaja analítica de la citometría de flujo tiene
4
como base la habilidad de hacer mediciones cuantitativas y multiparamétricas en un
número estadísticamente adecuado de células para definir las propiedades de una población
celular o de las subpoblaciones que la componen. El análisis multiparamétrico hace posible
evaluar poblaciones celulares particulares dentro de una mezcla compleja, ya que aprovecha
propiedades intrínsecas de la célula como la dispersión de la luz, y características
controladas como la fluorescencia. Al mismo tiempo, es posible separar las poblaciones
definidas por éste análisis (Parks D.R., et.al.; 1984). Estas ideas son la base de la técnica
conocida como FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting).
El FACS proporciona datos tales como el tamaño relativo de la célula, granularidad o
complejidad interna y la intensidad relativa de fluorescencia. Para llevar a cabo lo anterior,
el aparato necesita (como cualquier citómetro de flujo) de un sistema combinado de flujo,
óptica y electrónica (Figura 1). El sistema de flujo introduce y restringe a las células para
su análisis individual, el sistema óptico excita la muestra y colecta las señales de luz
provenientes de la misma y el sistema electrónico convierte la señal óptica en una señal
electrónica y la digitaliza para el análisis en computadora (Beckton Dickinson
Immunocytometry Systems; 1995). El sistema de citometría de flujo está compuesto por
cinco unidades principales: una fuente de luz (lámpara de mercurio o láser), flujo celular,
unidad de filtros ópticos para la detección de longitudes de onda específicas, fotodiodos o
fotomultiplicadores para la amplificación de la señal y una unidad de operación y
procesamiento de datos.
El funcionamiento del FACS es relativamente sencillo y se describe, brevemente, a
continuación. Una suspensión celular se inyecta al flujo laminar donde las células pasan
una después de la otra a través de un capilar y llegan hasta un rayo láser. Cuando este
rayo incide en una célula, la luz de excitación sale hacia delante y hacia los lados de la
célula y esto genera información. La luz dispersada hacia delante provee información sobre
el tamaño de la célula. La luz dispersada hacia los lados provee información sobre la
granularidad, tamaño y morfología celular. Si la célula va marcada con un fluoróforo, la
luz fluorescente se procesa, a través del fotomultiplicador, en el sistema procesador de datos
y los resultados son analizados por el software del citómetro. El FACS posee una unidad de
5
“sorteo” que ofrece la posibilidad de separar subpoblaciones seleccionadas. Las células se
cargan eléctricamente y las gotas resultantes se desvían al pasar a través de un campo
eléctrico. ¿Cómo sucede todo esto y cuáles son las bases de esta tecnología?
Figura 1. Esquema generalizado de los componentes de un citómetro-sorteador; la función de los componentes,
el procesamiento de la señal y la electrónica detrás del sorteo se describen más adelante en el texto (Bonner WA,
et.al.; 1972)
Historia del Instrumento
El FACS nació en el laboratorio de L.A. Herzenberg en 1968, se le llamó así por primera vez
en 1972, y se basó en las técnicas de separación de Sweet y en el sistema de flujo coaxial de
...