Electroforesis de ADN en gel de agarosa
Enviado por Benjamin Rodriguez Meza • 10 de Octubre de 2022 • Informes • 3.257 Palabras (14 Páginas) • 145 Visitas
Electroforesis de ADN en gel de agarosa.
INSTITUTO TECNOLOGICO METROPOLITANO
Kimberly Dayana Celeita Sepúlveda
Kimberlyceleita252636@correo.itm.edu.co
Benjamín Rodríguez meza
benjaminrodriguez310576@correo.itm.edu.co
Brayan Alejandro Mendoza puentes
brayanmendoza310326@correo.itm.edu.co
María Camila Mesa Sánchez
mariamesa304987@correo.itm.edu.co
Danna Alejandra Moreno Moreano
Dannamoreano304995@correo.itm.edu.co
Resumen
Este laboratorio se llevó acabo con la intención de poder medir la cantidad de ADN que estaba presente en las muestras tomadas en la práctica anterior esto a través de la técnica de electroforesis en gel de agarosa, la cual consistió en la preparación de un gel que funcionaria como una malla que impediría el paso de diferentes estructuras dependiendo su cantidad de pares de bases, lo que daría pie a que fuera posible identificar a estas gracias a su peso, esto medido por la posición en la cual se encontraban respecto a al marcador de peso, y a la intensidad de color que estas tuvieran.
Abstract
This laboratory was carried out with the intention of being able to measure the amount of DNA that was present in the samples taken in the previous practice, this through the agarose gel electrophoresis technique, which consisted in the preparation of a gel that would work as a mesh that would prevent the passage of different structures depending on their number of base pairs, which would make it possible to identify them thanks to their weight, this measured by the position in which they were with respect to the weight marker , and to the intensity of color that these had
Palabras Claves: Electroforesis, Buffer, Agarosa, ADN
Keywords: Electrophoresis, Buffer, Agarose, DNA
- Introducción:
En el presente laboratorio se espera aplicar el proceso de electroforesis en gel de agarosa esto con la finalidad de poder cuantificar la cantidad de ADN presente en las diferentes muestras, siendo necesario la utilización de diferentes reacciones y cambios físicos que hagan posible la viabilidad del experimento.
- Objetivos:
- Comprender e implementar la técnica de electroforesis en gel de agarosa para el análisis de ácidos nucleicos
- Recursos requeridos:
3.1. Equipos:
- Fuente de poder 20-150 v
- Cámara electroforética horizontal y accesorios
- Transiluminador con fuente de luz ultravioleta
- Placa de calentamiento con agitador magnético.
- Balanza analítica.
- Herramientas:
- Micropipetas
- Pipeteadores
- Materiales
- Caja Therazaki
- Espátula
- Puntas Plásticas Para micropipetas
- Parafilm
- Erlenmeyer de 100/200 ml
- Baker de 50 ml
- Probeta de 1 a 100 ml
- Microtubos de 1.5 ml
- Reactivos:
- Agua destilada
- Buffer TAE
- Ez-visión en gel.
- Marcador de peso geneRuler 100 bp plus para ADN.
- SYBR Green
- Agarosa.
- ADN purificado producto de PCR.
- Procedimiento:
- Primero se prepararon 50 ml de agarosa al 2 por ciento agregando 1 gramo de agarosa en un Erlenmeyer y luego el buffer TAE hasta completar un volumen de 50 ml. [pic 1]
- Se coloco la agarosa en una placa de calentamiento con agitador magnético durante 5 minutos, esto para disolver completamente la mezcla y evitar la formación de burbujas.[pic 2]
- Se dejo enfriar la solución por un rato y luego se sirvió en la bandeja, para seguidamente colocar el peine de 1 mm en esta y dejar solidificar el gel a temperatura ambiente por entre 30 – 45 minutos. [pic 3][pic 4]
- Mientras se esperaba que se solidificara el gel se realizo la siembra de muestras en la caja de Therazaki, esto agregando la muestra de ADN, el buffer de carga y el SYBR Green, a la vez de que se preparo el marcador de peso. [pic 5]
- Después de que el gel de agarosa se solidifique este debe de reubicarse teniendo en cuenta que los empaques de presión queden en posición paralela a los electrodos, luego se debe retirar el peine de forma firme y rápida, para al final inundar la cámara con buffer TAE hasta sobrepasar la matriz de agarosa.
- Luego de que la cámara este inundada se deben colocar las muestras en los pozos, estando en la primera posición el marcador de peso[pic 6]
- Luego de colocar las muestras en el gel la cámara se debe cerrar y colocar a 120v por una hora, al finalizar este tiempo se retira la bandeja que contiene al gel con cuidado, se coloca sobre el transiluminador UV y se observa la formación de las bandas. [pic 7]
- Consulta:
a) ¿Qué diferencias existen entre una electroforesis en gel y una capilar? ¿Mencione ventajas y desventajas de cada una? ¿Utilidad?
Electroforesis en gel
- Requiere más tiempo y mayor cantidad de muestra
- Tiene baja eficiencia, baja capacidad de análisis de muestras por unidad de tiempo.
- Dificultad para interpretar los resultados, cuando no se identifican todos los componentes de la muestra.
- Difícil de automatizar, por lo que es muy trabajosa en el momento de ejecutar múltiples muestras.
- La más indicada para trabajar es la electroforesis capilar debido a la rapidez, sensibilidad y seguridad en los resultados.
- (Kalstein, s.f.)Se pueden utilizar geles como:
- Almidón: siendo una técnica barata, fácil y rápida.
- Poliacrilamida: es el más usado en la electroforesis, de alta resolución, los componentes son tóxicos
- Agarosa: buena resolución, separación de moléculas grandes como virus, ácidos nucleicos, lipoproteínas
- Aplicaciones: En biología molecular, genética y bioquímicas usado en la clonación
- Para la separación de ácidos nucleicos
- Datos se registran con un gel de color
Electroforesis capilar
- Se realiza en minutos y requiere pequeñas cantidades de la muestra
- Es una técnica de alta sensibilidad y resolución
- Separación es rápida y se realiza con alto voltaje y requieren una automatización mínima con menor reactivo
- Una de las ventajas es que la matriz evita los efectos del calentamiento que pueden ocurrir en geles
- Los datos se registran en un papel
- Aplicaciones: En el área de investigación genómica y farmacéutica, en el diagnóstico molecular y clínico, además de aplicaciones en el área forenses, dando un ahorro en el tiempo y bajo costo.
- Separación y cuantificación de analitos como iones, péptidos, proteínas, carbohidratos, esteroides, ácidos nucleicos, vitaminas, fármacos y células.
- Se basa en migración diferencial de las moléculas sujetas a un campo eléctrico mediante un capilar muy pequeño
- Se emplean dos tubos capilares rellenos con buffer o gel
b) Realice un comparativo entre la electroforesis y la cromatografía de capa fina a nivel de la metodología y la utilidad.
Electroforesis | Cromatografía | |
¿Qué es? | Es una técnica de separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual se separa por tamaños de moléculas y carga eléctrica | Es una técnica de separación en el cual los componentes de la muestra se distribuyen en dos fases diferentes, como la consecuencia de la variación de velocidad al ser arrastrados por una fase móvil o fase estacionaria. |
Fundamento | Cuando una mezcla de molécula es colocada en un campo eléctrico, experimentando una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo en las moléculas para que se desplacen. | Las diferencias en el coeficiente de partición de los compuestos dan como resultado a una retención diferencial sobre la fase estacionaria, lo cual da una separación efectiva en función de los tiempos de retención. |
Técnica |
| La fase estacionaria se ubica sobre una placa plana o un papel.
Cromatografía en columna, la fase estacionaria se sitúa dentro de una columna.
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Aplicaciones |
| Es el mejor método analítico para la separación de gases, líquidos o solidos que pueden pasar fácilmente al estado de vapor o transformándolos en estados volátiles. |
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