Microbiologia

Técnicas en microbiología.

Tema 1. Generalidades.

Medios de cultivo:

Componentes más comunes:

• Compuestos aminonitrogenados: peptonas, extractos, infusiones, etc...Los microorganismos no suelen tener enzimas extracelulares con las que hidrolizar las proteínas para obtener nitrógeno, por ello es necesario suministrar extractos ya hidrolizados.

Peptonas: hidrolizado proteico fuente de nitrógeno. Se obtiene de diferentes formas, por hidrólisis enzimatica o por hidrólisis ácida, las dos formas dan resultados distintos. Las peptonas no son útiles para pruebas de identificación o caracterización por que poseen restos de azucares que podrían dar falsos positivos.

• Extractos de carne, malta, levadura..: el de levadura es el mas usado porque tiene vitaminas factores de crecimiento vitaminas y es fuente de N.

• Factores de crecimiento: sangre, suero, vitaminas, NADH, metales traza, aminoácidos,.... Hay que tener cuidado por si fuesen termolábiles, ya q no se podrían esterilizar en autoclave. También se usan como agentes protectores contra ciertos microorganismos.

• Fuentes de energía: generalmente glucosa.

• Sales tamponadas: citratos, acetatos, fosfatos, etc...para estabilizar el pH del medio.

• Sales minerales y metales: sulfatos, fosfatos, Ca, Fe, Mn, Mg, metales traza. Suelen ser contaminantes de otros compuestos. Se añaden especialmente cuando queremos detectar determinada actividad.

• Componentes especiales, agentes selectivos: son reactivos químicos, antibióticos, colorantes, inhibidores... para hacer medios selectivos o para identificar algún microorganismo, etc...

• Indicadores colorimétricos: indican el cambio de pH del medio durante el crecimiento y al final.

• Agentes solidificantes: agar, gelatina, alginatos, solidifican el medio. El mas usado es el agar: 2% para levaduras, 1'5% para bacterias y hongos, y 1-0'75% para pruebas de movilidad de bacterias.

Clases de medios:

• Medios generales o comunes: medios que permiten el crecimiento de un amplio espectro de microorganismos.

• Medios enriquecidos: son similares a los generales pero se les añade algún factor de crecimiento o suplemento de algún tipo.

• Medios de enriquecimiento: son los que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo frente al resto en una población mixta.

• Medios selectivos: permiten el crecimiento de ciertos microorganismos impidiendo que crezcan otros (TCBS para Vibrio).

• Medios diferenciales: se usan para identificar microorganismos.

• Medios mantenimiento y conservación: para conservar al microorganismo durante un gran periodo de tiempo.

o Congelación: a -80ºC. Los medios tiene concentraciones bajas de azucares y se suplementa con glicerol para evitar la formación de cristales de hielo. Se usan tubos eppendorff o criotubos.

o Las levaduras se conservan en agua a 4ºC en tubos con medio SLAM. Se añade parafina encima para producir anaerobiosis y proteger a las células.

o Liofilización: consiste en congelar y desecar la muestra.

Los medios los venden casi preparados, normalmente hay que disolverlos y esterilizarlos, si el medio lleva agar hay que hervirlo para que se disuelva y posteriormente autoclavarlo, esto cuando se distribuye en tubos.

Métodos de esterilización.

• Calor húmedo:

o Autoclave: 12ºC durante 15 minutos. El medio queda libre de microorganismos y esporas. No se puede usar con medios con elevadas concentraciones de azucares ya que estos caramelizan.

o Tindalización: tres ciclos de 100ºC que permiten el desarrollo de esporas entre dos ciclos sucesivos de modo que pueda acabar con ellas.

• Filtración: se usa con compuestos termolábiles. Las membranas de 0'22 micras son amicróbiocas, las de 0'45 permiten el paso de bacterias pero no de hongos ni levaduras.

• Calor seco: en cabinas y hornos a altas temperaturas. Son ciclos de 170ºC durante 90 minutos. Se usa para el vidrio.

• Agentes químicos: el material plástico de polietireno viene esterilizado por agentes químicos. Como el oxido de etileno liquido que no deja residuos.

• Radiaciones UVA y radiaciones gamma: las primeras esterilizan superficies las segundas se usan para medicamentos o productos que se vayan a envasar.

Tema 2.

Aislamiento y cultivo de muestras.

• Tipos de cultivo:

o Puro o axenico: procede de una sola célula.

o Mixto: por mas de una población.

o Bimembre: por un microorganismo que necesita, para vivir, el que nosotros estudiamos. Por ejemplo el cultivo de fagos necesita un césped bacteriano para desarrollarse.

• Los medios mas usados son:

o Para bacterias: TSA, TSB. Agar sangre y agar nutritivo.

o Para levaduras: YEPD, agar saboureau y agar malta.

o Para virus: céspedes celulares.

• Tipos de siembra:

o En placa por extensión:

o En placa por estrías:

o Por vertido en placa: se siembran 100microlitros de la muestra y sobre esta el medio de cultivo, después se autoclava. El crecimiento es dentro del medio.

o Replicador multipunto: permite siembra diferentes cepas en una misma placa. Se usa para pruebas de identificación.

o Por aislamiento en estría:

o En medio liquido.

• Los hongos se cultivan en cámaras húmedas.

Métodos de cuantificación.

• Cuantificación por cámara: puede ser una cámara Thoma o Neubauer. Una cámara Thoma esta dividida en 16 partes cada una dividida a su vez en 16 subunidades, en ella se meten 10-4 ml para el recuento. En una cámara de Neubauer también hay una primera división en 16 partes pero cada una de ellas esta dividida en 25 subunidades, también aquí se cargan 10-4 ml. Para hacer los cálculos de nº de cs por ml ver practicas.

• Test de opacidad: se usan unos tubos de referencia, tubos de McFarland, enumerados del 1 al 5 o del 1 al 8 de turbidez internacional que tienen diferente opacidad, el calculo se hace por comparación entre nuestra muestra y el tubo correspondiente.

• UFC: método que se realiza mediante siembra

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