Reaccion En Cadena De La Polimerasa (PCR)

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR es una tecnica de amplificacion de acidos nucleicos in vitro. Para realizar la PCR se debe conocer la secuencia del gen. En 1971, Kleppe propuso ingredientes básicos para amplificación in vitro de ácidos nucleicos. En 1983 Kary Mullis desarrollo la PCR. En 1985 Saiki amplifico un fragmento del gen de ß-globina.

Emplea un numero inespecifico de ciclos identicos: desnaturalizacion, alineacion y extencion.

Es capaz de amplificar muestras muy pequeñas que no son detectadas por otros métodos. Es mas sensible y especifica que otras técnicas.

Temperaturas:

*Desnaturalización: 96ºC

*Hibridación: 60ºC

*Polimerización: 72ºC

Ingredientes:

-Componentes de reacción

-ADN molde

-TAQ Polimerasa

-Iniciador

-dNTP's (ATP, CTP, GTP, TTP)

-Amortiguador

-Cloruro de magnesio

-Agua desionizada estéril

Los iniciadores son altamente específicos (18 a 30 bases).

Concentración optima de .1 a 1 microgramos

Concentracion G-C: 60-40%

Cloruro de Magnesio funciona como cofactir de la DNA prolimerasa. Concentracion optima de 1 a 2 mM. El exceso causa una amplificacion inespecifica y su concentracion baja causa la disminucion en la produccion del producto de PCR.

Amortiguador proporciona un pH optimo para la actividad de la DNA Polimerasa.

Amortiguador estándar 10x:

*KCI 500 mm

*Tris-HCI 100 mm pH 8.3

*Gelatina: .01%

Modalidades de PCR

-PCR Cualitativa

-PCR Semicuantitativa

-PCR Cuantitativa

-PCR Multiple (varias regiones o varios genes)

-PCR Selectiva (Detecta silvestre o mutado)

-PCR In situ

-PCR De tiempo real

*Multiple:

Limitantes: El numero de primers utilizados.

Precauciones: Que los primera no interacciones

*Anidada

*Selectiva:

RFLP's: Polimorfismos de longitud del fragmento de restricción.

Las variaciones en el DNA en los lugares de restricción que se detectan con el uso de enzimas de restricción.

Corte en CCGG.

*RT-PCR: Metodo utilizado para amplificar el cDNA copia de un RNA. Recupera y clona mRNA y genera grandes bibliotecas de cDNA. Identifica mutaciones y polimorfismos, fuerza de expresión genica, etc… Se realiza en una laminilla. Deteccion de genes y algunos virus.

-Oligo (dt): Se une a la cola de poli-A del mRNA. Cuando es usado, el primer se vuelve mas especifico.

-Random hexamero: Secuencias aleatorias que se unen a cualquier RNA.

El Virus de Mieloblastosis Aviar y el Virus de la Leucemia Murina Moloney son las retrotranscriptasas mas usadas. Re quieren un RNA o DNA plantilla. Se unen al extremo

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