Anafilaxis

mentan a 150 g durante

10 min a temperatura ambiente y se resuspenden

en 1 mL de disolución reguladora Tyrode B.33

Una vez resuspendidas, las células de mastocitos se

separan de los componentes principales de las células

peritoneales de las ratas (macrófagos, pequeños linfocitos,

entre otros) de acuerdo con el método descrito por

Yurt y cols.34 Para ello, se añaden 2 mL de metrizamida al

22,5 % (1,120 g/mL de densidad) a las células peritoneales

suspendidas en 1 mL de disolución reguladora Tyrode

B, las cuales se centrifugan a 400 g durante 15 min a

temperatura ambiente. Las células remanentes en la

interfase disolución reguladora - metrizamida se aspiran

y se desechan, mientras las células en el precipitado se

lavan y se resuspenden en 1 mL de disolución reguladora

Tyrode A {10 mmol/L de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-

N-2-etanosulfónico (HEPES), 130 mmol/L de NaCl,

5 mmol/L de KCl, 1,4 mmol/L de CaCl2, 1 mmol/L MgCl2,

5,6 mmol/L de glucosa pH = 7,4} con 0,1 % de seroalbúmina

bovina. Las preparaciones de las células de mastocitos

obtenidas son aproximadamente 95 % puras según

el ensayo de tinción de azul de toluidina y más del 97 %

viable según la exclusión de azul de Trepan.35

Las suspensiones de células de mastocitos purificadas

(2 ⋅ 105 células/mL) se pre-incuban a 37 °C durante

10 min para su estabilización antes de añadir el compuesto

48/80 (5 mg/L).30 La sustancia de prueba y el cromoglicato

disódico (sustancia de referencia) se añaden

respectivamente a los 10 min y 30 s previos, de añadir

el compuesto 48/80.36 Las células son incubadas con el

compuesto 48/80 durante 20 min . La reacción se detiene

por enfriamiento de los tubos con hielo y las células se

separan de la histamina liberada por centrifugación a

400 g durante 5 min a 4 °C . La histamina residual en las

células se libera por lisis de las células con ácido perclórico

y centrifugación ulterior a 400 g durante 5 min a 4 °C .31 El

contenido de histamina se determina mediante el método

espectrofluorométrico OPA (o-ftaldialdehído).37 La

intensidad fluorescente se mide a 438 nm y el porcentaje

de inhibición de la histamina liberada se calcula usando

la ecuación siguiente:

Inhibición = (A – B) · 100/A (%)

donde:

A cantidad de histamina liberada en ausencia de la

sustancia de prueba.

B cantidad liberada desde las células tratadas con la

sustancia de prueba.18,22,31,38

Otras alternativas emplean 10 mL de disolución reguladora

Tyrode A (10 mmol/L de HEPES, 136 mmol/L de

NaCl, 5 mmol/L de KCl, 2 mmol/L de CaCl2, 2,75 mmol/L

de MgCl2, 5,6 mmol/L de glucosa, 11 mol/L de NaHCO3,

0,56 mmol/L de NaH2PO4 y 0,1 % de suero bovino) con 0,1 %

de gelatina para el aislamiento de células de mastocitos

peritoneales en ratas machos Sprague Dawley.38

B. Medición de la recaptación de Ca45 en las células de

mastocitos peritoneales de ratas

La medición de la recaptación de calcio constituye un

indicador de la presencia de una reacción dependiente de

los mastocitos. La recaptación de calcio en las células de

mastocitos se mide de acuerdo con el método de Chai y cols.39

para lo cual las células de mastocitos peritoneales de ratas

(CMPR) se resuspenden en disolución reguladora Tyrode

- HEPES que contiene Ca45 (1,5 mCi/mL; 1 Ci = 3,7 · 1010 Bq)

y se incuban a 4 °C durante 10 min . Las suspensiones de

las células de mastocitos se pre-incuban con la sustancia

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