Analisis de aguas microbiologico

1. Objetivo

Análisis microbiológico para aguas de uso farmacéutico no estéril.

1. Alcance

Este instructivo aplica para aquellas muestras de aguas de tipo farmacéuticos, no estéril, que requiera de recuento microbiano y recuento de patógenos. No aplica para productos estériles.

1. Definiciones

Bacterias aerobias mesófilas: Son todos aquellos microorganismos que son afines a crecer a temperaturas medias entre los 30 a 37ºC y dependientes de oxígeno.

Materiales y Reactivos

• Agar PCA plate count Agar
• Caldo Lauril Sulfato
• Agar MacConkey
• Campanas Durham
• Tubos de 20 ml
• Placas petri de plastico o de vidrio esteril de 90 -100 mm
• Pipetas de 1 – 5 -10 graduadas en 0,1 ml.
• Baño termoregulado entre 44 a 46  ºC
• Incubadora 30 a 35°C

1. Flujograma

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1. Procedimiento

4.1 Vertido en placa

1. Etiquetar Placas estériles con el número de análisis y dilución a utilizar. (realizar por duplicado)
2. Realizar diluciones seriadas si es necesario. De solución madre tomar 1ml de agua y verter en tubo de agua peptonada con 9 ml vortex, (Dilución 10-1). Del tubo 10-1, tomar 1 ml y verter en un nuevo tubo con Agua peptonada de 9 ml vortex (dilución 10-2), realizar las diluciones hasta llegar a la dilución 10-4.
3. Siembre al menos dos diluciones, si a muestra es sospechosa de contaminación utilizar las diluciones de 10-3 y 10-4.
4. Por cada dilución agregar entre 0,1 a 1 ml de muestra seleccionada a la placa Petri estéril, utilizando dos placas. Si es necesario realice una siembra directamente de la solución madre, y de las diluciones.
5. Verter el agar plate count (PCA), directamente a la muestra que está en placa aproximadamente 25 ml de agar. El Agar debe estar entre 44 a 46 ºC, para evitar choque térmico significativo a las bacterias.
6. Homogenizar utilizando la técnica del 8. (ver anexo 1)
7. Incubar las placas Petri a 33,0 ºC entre 24 a 48 horas

4.2 Verificación de coliformes

1. Preparar agar VRBD para enterobacterias (este medio no se esteriliza) y agar MacConkey, como indique el fabricante.
2. Sembrar dos placas con diluciones conocidas por el método de vertido en placa. Realice siembra profunda de dos capas para crecimiento de microorganismos facultativos en agar VRBD. (ver anexo 2)
3. Incubar placas por 24 horas a 33,0 °C
4. Las colonias sospechosas repicar y sembrar en caldo lauril sulfato.

Confirmación de coliformes totales.

1. Preparar una batería de tubos de ensayos de 20 ml, e introducir una campana Durham con la abertura boca abajo.
2. Preparar caldo lauril sulfato como indique el fabricante
3. Llenar cada tubo con 10 ml de caldo Lauril Sulfato, y esterilizar por 15 min a 121 °C.
4. Incubar a 33,0 a 35,0 °C por 48 horas.
5. Los resultados positivos confirman posible presencia de coliformes totales.

Esquema de la dilución y siembra

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1. Interpretación de resultados

Recuento total.

Se deberán contar todas las colonias desarrolladas en cada placa. Las colonias por lo general son pequeñas y blancas.

Si se ha sembrado más de una dilución se seleccionará la que proporcione entre 30 y 300 colonias, descartando las demás. El recuento no se efectuará en placas que contengan menos de 30 colonias, excepto en aquellas sembradas con solución sin diluir.

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