CUTINASAS

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Practica 1: ¨Producción de cutinasas ¨

1. Objetivo y Alcance

1. Objetivo.

Producción y características de cutinasas

1. Alcance

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1. Seguridad y declaraciones

1. Indicaciones de seguridad

1. Términos específicos

1. Vigencia

Cuatrimestre MAYO-AGOSTO cuatro sesiones del 28 de mayo al 31 de agosto del 2020

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1. Desarrollo de la práctica

1. Equipo necesario para el desarrollo de la práctica

1. Sustancias o insumos (Por equipo de alumnos)

1. “Fase 1 de la práctica: Preparación de la muestra.

1. Tomar una muestra de F. culmorum previamente obtenido con asa de platino e inculcarlo en medio de cultivo Agar extracto de malta y dejarlo crecer a 20°C por 5 dias y conservarlo a 4°C
2. Tomar las manzanas y pelarlas para después colocarlas en un vaso de precipitados, añadir al vaso de precipitados la solución de oxalato de sodio. Hervir por 30 minutos para separar la pulpa restante de la cascara
3. Filtrar las cascaras y secarlas en frio a -40°C por 12h
4. Liofilizar y agregar la solución metanol y dicloro metano al material liofilizado, dejar actuar durante una noche
5. Filtrar la solución para obtener la cutina y someterla a evaporación rotatoria a 45°C para obtener cutina en polvo
6. Preparar 4 medios con las siguientes características

1. Esterilizar 4 matraces en autoclave a 120°C durante 15min, enfriar a temperatura ambiente, añadir a cada uno un medio de cultivo 1 cubo de poliuretano e inocular con 3 tapones miceliales
2. Incubar a 22°C durante 5 días, tomando muestras a las 16h por triplicado
3. Separar la biomasa del sobrenadante por filtración, pasar a un horno en crisol y pesar

“Fase 2 de la práctica: Análisis y medición de la muestra

1. Realizar el ensayo de glucosa en espectrofotómetro añadiendo DNS a tubo de ensayo junto con el sobrenadante de la muestra, incumbir por 5 minutos, inmediatamente transferir a agua fría por otros 5 minutos, finalmente calibrar espectrofotómetro con 1ml de agua destilada y 2 ml de DNS y detectar a 575nm
2. Utilizar el ensayo de la proteína de bradfort para determinar la producción de proteínas. Añadir 950ul del reactivo de Bradford a un tubo de ensayo con 40 ml de cada supernadante
3. Utilizar el espectrofotómetro Jenway 595nm para evaluar la producción de proteínas
4. Medir la actividad de cutinasa por espectrofotometría a 405nm añadiendo 900ul de substrato y 100ul de muestra de supernadante
5. Medir la actividad cutinasa por electroforesis en gel de poliacrilamida, Analizar en geles de 0.75mm a 100 voltios durante 1:30h
6. Detectar la actividad cutinasa por bandas color rojo en los geles

“Fase 3 de la práctica: Análisis de resultados y cálculos

Las cutinasas son enzimas producidas principalmente por hongos fitopatógenos, cuya relación con la patogenicidad del microorganismo y su efecto en la invasión al huésped sigue en controversia.

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