Callogenesis

Inducción y Cultivo in Vitro de callo

de Rubus idaeus L. 1753 “Frambueso”

Ascenso, A(1); Chavarry, J(1); Molano, J(1); Pacheco, A(1); Quiñones, M(2)

1 Estudiantes del taller de biotecnología vegetal, 2 Profesor del taller de biotecnología vegetal

Laboratorio de Biotecnología vegetal

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Ricardo Palma.

Av. Benavides 5440, Lima 33-Peru.

Abstract

Knowing that Rubus idaeus L. 1753 "Raspberry", and other berries, is vulnerable to a variety of pathogens, eradication of these is essential for good production. This can be achieved by in vitro genetic improvement through callus culture that causes genetic variation in order to obtain plants resistant to pathogens. We performed in vitro induction of callus culture on Murashige-Skoog medium with 2,4-D and coconut water. Explants were obtained from stems and young leaves, which were sterilized with sodium hypochlorite 2.5%. and cultured in darkness at a temperature between 18-22 ° C. 62.5% of the explants, which were the leaves did not develop callus because they phenolized, fungal organisms were witnessed by 12.5%. Callus formation was achieved in 25% of explants, which were from stem, by an average of 1 week and a half. There were whitish callus of compact nature with a viability of 75.5%, even more compact yellow callus with a viability of 19.5% and not so compact greenish callus with a viability of 37.1%.

Resumen

Conociendo que Rubus idaeus L. 1753 “Frambueso”, así como otras berries, es vulnerable a una diversidad de patógenos, la erradicación de éstos es imprescindible para una buena producción. Esto se puede lograr mediante el mejoramiento genético in vitro a través del cultivo de callo que provoca variación genética y así obtener plantas resistentes a patógenos. Se realizó la inducción y cultivo in vitro de callo en el medio Murashige-Skoog con 2,4-D y agua de coco. Se obtuvieron explantes de tallo y hojas jóvenes, los cuáles fueron esterilizados con hipoclorito de sodio al 2,5%. y cultivados en oscuridad a una temperatura entre 18-22 ºC. El 62,5 % de los explantes, que fueron las hojas, no desarrollaron callo debido a que se fenolizaron; se presenciaron organismos fúngicos en un 12.5%. Se logró la formación de callo en el 25 % de los explantes, que fueron tallos, en un promedio de 1 semana y media. Se presentaron callos blanquecinos de naturaleza compacta con una viabilidad de 75.5%, callos amarillentos aún más compactos con una viabilidad de 19.5% y callo verduzcos no tan compactos y viabilidad de 37.1%.

Palabras claves: callo, Rubus idaeus, medio MS

Introducción

El frambueso Rubus idaeus L. 1753 es una planta anual de porte arbustivo de la familia Rosaceae e integra el grupo de las “berries”, que incluye arándanos, frutilla, grosella, mora y zarzamora. El frambueso es originario del monte Ida en Grecia, puede alcanzar una altura de 2 metros aproximadamente y sus frutos son polidrupas de color rojo y forma esférica.

La frambuesa es de interés económico en diversos mercados debido a su exquisito sabor, sobre todo en los mercados Europeos y los Estados Unidos. Se utiliza como materia prima para elaborar productos alimenticios (repostería y refrescos). Asimismo, se han identificado propiedades medicinales como antirreumático, tónico, antiescorbútico, astringente, depurativo, diurético e incluso anticancerígeno.

La planta de frambuesa es vulnerable a muchos patógenos especialmente hongos como, Elsinoe veneta, Lepthosphaeria coniothyrium, Septoria spp., Dydimella applanata y Botrytis cinerea. Esta última se manifiesta en la época de maduración como una mancha amarillenta blancuzca pequeña, la cual se extiende rápidamente y contamina a todo el fruto.

El frambueso también es atacado por virus como RBDV (Raspberry Bushy Dwarf Virus), TomRSV (Tomato Ringspot Nepovirus) y TSV (Tobacco Streak Ilarvirus que se transmiten mediante semillas y polen, provocando múltiples síntomas en las plantas, como reducción en la altura de los tallos, clorosis, fruta de baja calidad y disminución de la cosecha.

Es por eso que uno de los objetivos de la biotecnología de los cultivos in vitro es el mejoramiento genético que le permita a la planta ser resistente a los patógenos. Una de las formas con las que se pueden obtener estos resultados es mediante la inducción de callo.

El callo es una masa amorfa de células desdiferenciadas de naturaleza tumoral y de origen cicatrical, obtenidas a partir de explantes de órganos de la planta (las hojas, yemas, tallo, polen y otros), el cual es inducido por la fitohormona (2,4D) que genera la desdiferenciación. Este proceso provoca la variación somaclonal, obteniendo plantas resistentes a patógenos a partir de un cultivo celular in vitro.

Por esta razón, el objetivo de este trabajo fue inducir y cultivar callo in Vitro de explantes de hoja y tallo de frambueso Rubus idaeus L. 1753 en medio de cultivo Murashigue Skoog (MS) con 2,4-D.

Materiales y métodos

Materiales

Se utilizó como material biológico a una planta de Rubus idaeus L. “Frambueso”. En materiales de vidrio utilizamos beakers de 50 mL, tubos de ensayo (150 x 25ml) y placas Petri 120 x 20. En el caso de los reactivos utilizamos medio de cultivo Murashigue & Skoog (MS), 2,4-Diclorogenoxiacetico, detergente, etanol 96°, hipoclorito de sodio 2.5% y azul de metileno. También se utilizaron equipos, como autoclave, cámara de flujo laminar horizontal, cámara de cultivo, cámara fotográfica y microscopio.

Métodos

La planta madre de Rubus idaeus L. “Frambueso”, se obtuvo del vivero Los Inkas en Santiago de Surco, luego transportada al invernadero de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Ricardo Palma.

El medio Murashigue & Skoog (MS) se preparó a partir de una alícuota de solución Stock concentrada 10 veces, preparada con macro y microelementos, vitaminas y quelatos de Fe. Siendo sumplementado con 2,4-Diclorofenoxiacetico (1ml/1L), agua de coco y gel rite, a un pH 6.5. El medio se sirvió en tubos de ensayo (150 x 25ml), sellados con papel platino para ser autoclavados.

Se extrajeron 4 segmentos del tallo cercanos al meristemo apical y 4 segmentos de hojas jóvenes. Estos fueron lavados con detergente comercial y agua de grifo en un beaker, siendo removidos con la ayuda de un cepillo de dientes. Se decantó tantas veces sean necesarias, hasta disolver por completo el detergente, siguiendo el mismo procedimiento, siendo finalmente enjuagados con agua destilada.

Estos segmento de la planta se llevaron a una cámara flujo laminar horizontal, en donde se sumergieron en alcohol etílico 96° por 30 segundos, en un beaker, para que se abran los poros, luego se enjuagaron en agua destilada estéril. Para esterilizarlos, estos fueron sumergidos en solución de hipoclorito de sodio al 2.5% durante 5 minutos y luego se enjuagaron en agua destilada estéril. Este procedimiento de esterilización se realizó 5 veces.

Una vez esterilizados, se obtuvieron los explantes a partir de estos segmentos de tallo y de las hojas. Para obtener los explantes de los tallos, a cada segmento se le extrajo la corteza y se cortaron los extremos; en el caso de las hojas, se cortó una sección de la hoja con mucho cuidado de no dañar la nervadura central.

Posteriormente, los explantes fueron introducidos en tubos de ensayo con el medio MS y sellados con papel platino. Esta operación también se realizó dentro de la cámara de flujo laminar. Luego, los explantes sembrados en tubos fueron llevados a una cámara de cultivo, bajo condiciones de oscuridad a una temperatura entre 18-22 ºC y se realizó un monitoreo interdiario de los tubos, para determinar si hubo contaminación, formación de callo, color del explante y fenolizacion.

Por último, se procedió a determinar la viabilidad del callo de Rubus idaeus L. Para esto se extrajo una parte de cada callo formado y se les dividió en 10 pedazos, que fueron distribuidos en 10 láminas, coloreados con azul de metileno y luego de 5 min se realizó el squash. Inmediatamente, las muestras fueron observadas al microscopio y de un grupo de 100 células se contaron las células que se colorearon (no viables) y las células sin colorear (viables), obteniéndose así el porcentaje de viabilidad de cada callo.

Resultados

La esterilización con hipoclorito de sodio al 2.5% resultó adecuada en un 66.7% en el caso de los explantes de tallo, es decir, solo 2 de los 3 explantes no se contaminaron (T2 y T3), en cambio uno de los explantes (33.3%) presentó contaminación con una colonia de Aspergillus sp., un hongo de apariencia algodonosa y blanquecina (Ver Imagen 1, Anexo 2.1). En el caso de las hojas, el 100% no presentaron contaminación ni se formo callo debido a que el efecto del hipoclorito al 2.5% fue muy abrasivo, lo cual causo necrosis (Ver Imágenes 2-4, Anexo 2.2).

Tabla 1. inducción de callo en los explantes de tallo y hojas de Rubus idaeus L.

Tipo de Explante N° de Explante Días/Observaciones

Día 10 Día 11

Tallo T1 Contaminación con Aspergillus sp. Contaminación con Aspergillus sp.

T2 Explante verde

No callo Explante verde

Formación de Callo

T3 Explante verde

Formación de callo Explante verde

Callo

Hoja H1 Necrosado Necrosado

H2 Necrosado Necrosado

H3 Necrosado Necrosado

H4 Necrosado Necrosado

H5 Necrosado Necrosado

En los explantes de tallo se evidencio callo en un 66.7%. En T2 se evidencio callo a los 10 días, mientras

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