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CAPÍTULO 9

Medios y suplementos definidos

9.1 DESARROLLO DE LOS MEDIOS DE COMUNICACIÓN

Los primeros intentos de cultivar células se realizaron en recursos naturales los medios de comunicación basados en extractos de tejidos y fluidos corporales, tales como polluelo extracto de embrión, suero, linfa, etc, con la propagación de líneas celulares, la demanda de una mayor cantidad de un medio de calidad más consistente conducido a la introducción de medios químicamente definidos sobre la base de análisis de fluidos corporales y bioquímica nutricional. Medio basal de Eagle [Eagle, 1955] y, posteriormente, medio esencial mínimo de Eagle (MEM) [Eagle, 1959] llegó a ser ampliamente adoptado diversas suplementado con ternera, humano, o suero de caballo, proteína hidrolizados, y el extracto de embrión. Como célula más continuo las líneas estaban disponibles (células L929, HeLa, etc), era evidente que estos medios eran perfectamente adecuado para la mayoría de los esas líneas, y la mayoría de los desarrollos posteriores fueron destinada a sustituir el suero (véase la Sección 10.2), optimización de medios para diferentes tipos de células (por ejemplo, medio RPMI 1640 para linfoblastoide líneas de células), o la modificación de las condiciones específicas (por ejemplo, Leibovitz L15 a eliminar la necesidad de la adición de CO2 y NaHCO3) [Leibovitz, 1963].

El aislamiento y la propagación de células de un linaje específico puede requieren un medio libre de suero selectivo (véase la sección 10.2.1), mientras que las células cultivadas para la formación de productos, como anfitriones para la propagación viral, o para estudios moleculares no específicos de la célula se basan principalmente en MEM de Eagle [Eagle, 1959], de Dulbecco modificación del medio de Eagle, medio DMEM [Dulbecco y Freeman, 1959], o, cada vez más, RPMI 1640 [Moore et al., 1967], suplementado con suero. Sin embargo, muchos técnicas de producción a escala industrial utilizan ahora libre de suero medios de comunicación, para facilitar los procesos posteriores y reducir el riesgo de agentes infecciosos adventicias (véase la Sección 10.1). la compromiso popular para muchos laboratorios es una mezcla de un medio complejo, tales como F12 de Ham [jamón, 1965], con uno con más alta de aminoácidos y las concentraciones de vitamina, tales como DMEM. Esta alternativa se horrorizan los puristas, pero sí generar un medio útil, todo uso de cultivos primarios como así como la propagación de la línea celular.

Este capítulo se centra en los principios generales de la composición del medio, utilizando el ampliamente utilizado suero medios suplementados como ejemplos, y el Capítulo 10 se centrarán en el diseño y uso de medios libres de suero.

9.2 PROPIEDADES FISICO

9.2.1 pH

La mayoría de las líneas celulares crecen bien a pH 7,4. Aunque la óptima pH para el crecimiento celular varía relativamente poco entre los diferentes cepas de células, algunas líneas de fibroblastos normales funcionan mejor a pH 07.04 a 07.07, y las células transformadas pueden hacer mejor a un pH de 7,0 a 7,4 [Eagle, 1973]. Se informó de que las células epidérmicas pueden ser mantenido a pH 5.5 [Eisinger et al., 1979], pero este nivel ha no se ha adoptado universalmente. En casos especiales puede resultar conveniente hacer un breve experimento de crecimiento (ver Protocolos 21.7 y 21.8), el ensayo de eficiencia de plaqueo (ver sección 21.10), o análisis de función especial (por ejemplo, véase la Sección 17.7) para determinar el pH óptimo.

Rojo fenol se usa comúnmente como un indicador. Es de color rojo en pH 7,4 y se convierte en naranja a un pH de 7,0, de color amarillo a un pH de 6,5, amarillo limón debajo de pH 6,5, más rosa a pH 7,6, y púrpura a pH 7,8 (véase la lámina 22b). Debido a que la evaluación del color es altamente subjetiva, es útil para hacer un conjunto de normas el uso de una solución estéril salina equilibrada (BSS) con rojo fenol a la concentración correcta, en el mismo tipo de botella, con el mismo espacio de cabeza de aire, que se utiliza normalmente para la preparación un medio. El siguiente ejemplo se usará 25 cm2 cultura Matraces como los recipientes finales y pueden ser utilizados en conjunción con el ejercicio 8.

9.2.2 CO2 y bicarbonato

El dióxido de carbono en la fase de gas se disuelve en el medio, establece equilibrio con HCO3 - iones, y disminuye el pH. Como el CO2 disuelto, HCO3 - y pH están interrelacionados, es difícil determinar el principal efecto directo de CO2.

La tensión de CO2 en la atmósfera va a regular la concentración de CO2 disuelto directamente, como una función de la temperatura. Esta norma a su vez produce H2 CO3, que se disocia de acuerdo con la reacción

H2 O

CO2 + H2 CO3 ⇔ ⇔ H + + HCO3 - (1)

HCO3 - tiene una constante con la mayoría bastante baja disociación de los cationes disponibles por lo que tiende a volver a asociar, dejando el medio ácido. El resultado neto del aumento de CO2 atmosférico es para deprimir el pH, por lo que el efecto de la elevación de la tensión de CO2 es neutralizado mediante el aumento de la concentración de bicarbonato:

NaHCO3

⇔ Na + + HCO3 - (2)

El aumento de HCO3 - concentración empuja la ecuación (1) a la izquierda hasta que se alcanza el equilibrio a pH 7,4. Si otro alcalino (por ejemplo, NaOH) se utiliza en lugar, el resultado neto es el mismo:

NaOH

+ H2 CO3 ⇔ NaHCO3 + H2O ⇔ Na +

+ HCO3 - + H2 O (3)

Los NaHCO3 concentraciones equivalentes comúnmente utilizados con diferentes tensiones de CO2 se enumeran en las Tablas 9.1, 9.2, y 9.3. Los valores intermedios de CO2 y HCO3 – pueden ser usado, a condición de que la concentración de tanto se varía proporcionalmente. Debido a que muchos medios se componen en ácido solución y puede incorporar un tampón, que es difícil de predecir la cantidad de bicarbonato de utilizar cuando otros también pueden alcalino terminar como bicarbonato, como en la ecuación (3). Cuando se prepara un nuevo medio para la primera vez, añadir la cantidad especificada de NaOH y luego bicarbonato de suficiente 1 de tal manera que el medio se equilibra al pH deseado después de la incubación en una placa de Petri a 37 ◦ C, en la concentración de CO2 correcta, durante la noche. Cuando se trata de un medio que ya está en la fuerza de trabajo, variar la cantidad de HCO3 - para adaptarse a la fase de gas (véase la Tabla 9.1), y dejar el medio durante la noche equilibrar a 37 ◦ C. Cada medio tiene un recomendada concentración de bicarbonato y la tensión de CO2 para el logro de la pH y la osmolalidad correcta, pero las variaciones menores se producirán en diferentes métodos de preparación.

Con la introducción de tampones de Good (por ejemplo, HEPES, Tricina) [Good et al., 1966] en cultivo de tejidos, no había algunas especulaciones de que, en forma de CO2 ya no era necesario estabilizar el pH, que podría ser omitido. Esto resultó ser falso [Itagaki y Kimura, 1974], por lo menos para un número grande de tipos de células, particularmente a concentraciones bajas de células. Aunque 20 mM de HEPES pueden controlar el pH dentro de la fisiológica gama, la ausencia de CO2 atmosférico permite la ecuación (1) mover hacia la izquierda, hasta llegar a eliminar el CO2 disuelto, y en última instancia, HCO3 -, a partir del medio. Esta cadena de eventos parece limitar el crecimiento celular, aunque si el células requieren el CO2 disuelto o el HCO3 - (o ambos) no está claro. Recomendado HCO3 -, CO2, y HEPES las concentraciones se dan en la Tabla 9.1.

La inclusión de piruvato en el medio permite células para aumentar su producción endógena de CO2, haciéndolos independiente de CO2 exógenos, así como HCO3 -. Leibovitz L15 [Leibovitz, 1963] contiene una mayor concentración de piruvato de sodio (550 mg / L) pero carece de NaHCO3 y no requiere CO2 en la fase gaseosa. Buffering se logra a través de la relativamente alta las concentraciones de aminoácidos. Debido a que no requiere CO2, L15 se recomienda a veces para el transporte de muestras de tejido. Sodio β-glicerofosfato también puede ser utilizado para amortiguar los medios de comunicación carecen de CO2 y autoclavables HCO3 - [Waymouth, 1979], y los mercados de Invitrogen un CO2 - medio independiente. Si la eliminación de CO2 es importante para ahorrar costos, conveniencia, o por otras razones, puede ser vale la pena considerar una de estas formulaciones, pero sólo después de las pruebas adecuadas.

En resumen, las culturas en recipientes abiertos deben ser incubados en una atmósfera de CO2, la concentración de los cuales está en equilibrio con el bicarbonato de sodio en el medio (Véanse los cuadros 9.1, 9.2 y 9.3). Las células en moderadamente alta concentraciones (≥ 1 × 105 células / ml) y cultivadas en sellada frascos no necesitan CO2 han añadido a la fase gaseosa, siempre que la concentración de bicarbonato se mantiene baja (~ 4 mM), en particular si las células son productores de ácido altos. En niveles bajos de glóbulos concentraciones, sin embargo (por ejemplo, durante la clonación), y con algunos cultivos primarios, es necesario añadir CO2 al gas fase de frascos sellados. Cuando se requiere ventilación, para permitir ya sea el equilibrio de CO2 o su escape en el ácido de alta productores, es necesario dejar la holgura tapa o utilizar un Tapa de CO2-permeable (ver fig. 8.8).

9.2.3 Buffering

Los medios de cultivo se tienen que guardar bajo dos conjuntos de condiciones: (1) platos abiertos, en los que la evolución de CO2 hace que el pH aumentando (véase la Sección 9.2.2), y (2) la sobreproducción de CO2 y ácido láctico en líneas celulares transformadas con alto

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