ELECTOROFORESIS

Trabajo de laboratorio:

Estudio de la estructura de una proteína por electroforesis en gel de poliacrilamida

Objetivo

El objetivo es dilucidar la composición de cadenas polipeptídicas de una proteína utilizando electroforesis en gel de acrilamida en condiciones desnaturalizantes, tanto en presencia como en ausencia de un agente reductor.

Procedimiento

En este trabajo, se analizará la inmunoglobulina de tipo G (IgG). Estas son proteínas presentes en el suero de mamíferos que participan en la respuesta inmunológica. Su peso molecular nativo es aproximadamente 120-150 kDa.

Receta para la preparación de geles de poliacrilamida desnaturalizantes (esta etapa será realizada por el instructor)

Todos los buffer contienen SDS. La muestra de proteínas se mezcla con buffer de siembra que contiene SDS y se agrega 2-mercaptoetanol. Antes de sembrarla en el gel, se calienta 2 minutos en baño de agua hirviente.

Gel de separación (5 ml finales) 8% acrilamida 12% acrilamida

H2O desionizada 2.34 ml 1.67 ml

Buffer de separación (Tris.HCl 1.5M pH 8.8, 4X) 1.25 ml 1.25 ml

Acrilamida-Bis-acrilamida (30:0.8%): 1.33 ml 2.00 ml

SDS 10% 50 µl 50 µl

(NH4)2S2O8 10% 25 µl 25 µl

TEMED 2.5 µl 2.5 µl

Gel de apilamiento (2.5 ml finales) 4% acrilamida

H2O 1.50 ml

Buffer apilamiento (Tris.ClH 0.5M pH 6.8, 4X) 0.625 ml

Acrilamida-Bis-acrilamida (30:0.8%) 0.325 ml

SDS 10% 25 µl

(NH4)2S2O8 10% 12.5 µl

TEMED 2.5 µl

NOTA: La acrilamida es neurotóxica. Tomar las precauciones necesarias para evitar el contacto con mucosas o piel.

Composición de los buffers stock (soluciones concentradas):

Buffer de muestra desnaturalizante (4X): Tris.HCl (pH 6.8) 0.2 M

SDS 8% p/v

Azul de bromofenol 0.004% p/v

Glicerol 40% p/v

(Agregar de 2-mercaptoetanol hasta 5% (v/v), para generar condiciones reductoras).

Buffer de electroforesis (10X, pH 8.3): Tris 0.25 M

Glicina 1.92M

SDS 1% p/v

Se diluye en el momento de usar con agua desionizada.

Marcadores de PM disponibles (en buffer de siembra, listos para calentar y sembrar)

Bajo PM (kDa): 66, 45, 36, 29, 24, 20, 14.2, 6.5. (se usará para el gel 12% acrilamida)

Alto PM (kDa): 205, 116, 97.4, 84, 66, 55, 45, 36 (se usará para el gel 8% acrilamida)

Preparación de las muestras: Para visualización de polipéptidos por tinción con Azul de Coomasie, se recomienda colocar más de 5 µg de proteína total, especialmente si la muestra contiene muchas proteínas diferentes. El volumen máximo admitido en una fosa de un gel de 0.75 mm de espesor es de 25 µl. Sembrar diferentes cantidades de la proteína en distintas calles de los geles, para ver la sensibilidad de detección del colorante (por ejemplo, 0.5, 1, 2 5 y 10 µg de proteína). A partir de la muestra stock de IgG, hacer los cálculos para la preparación de cada una de las muestras.

Preparar entonces cada muestra en un microtubo (de 0.5 ml) distinto. Para cada cantidad de IgG, preparar dos muestras idénticas; a una de ellas no se le agregará mercaptoetanol. El orden de agregado de las soluciones debe ser: agua desionizada, buffer de siembra, mercaptoetanol y proteína. Evitar la formación de espuma al agregar el buffer de siembra que contiene SDS. Cuando están todas las muestras listas, se colocan en un flotador en un baño de agua hirviente durante 2 min. Antes de sembrarlas en el gel, es recomendable someterlas a una breve centrifugación para colectar las microgotas eventualmente formadas en las paredes de los

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