ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS: ADN

UNIVERSIDAD NACIONAL

FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE TECNOLOGIA MÉDICA

ESCUELA PROFESIONAL DE LABORATORIO Y ANATOMIA PATOLOGICA

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ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS: ADN

DOCENTE:

MSc. ALARCON BALDEON JHONATAN

ALUMNO:

OLAYA GIL JEAN

2017

INTRODUCCION

El término electroforesis se usa para describir la migración de una partícula cargada positiva o negativamente bajo la influencia de un campo eléctrico. Muchas moléculas importantes biológicamente (aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos, etc) poseen grupos ionizables y existen en solución como especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas se van a separar en función de su carga cuando se aplica un voltaje a través de los electrodos. Existen muchos tipos de electroforesis, que se engloban en dos categorías fundamentales:

-Electroforesis de frente móvil.

-Electroforesis de zona.

El gran avance en el campo de la biología molecular, ha generado una gran cantidad de técnicas que requieren el uso de la electroforesis, lo que supone una parte importante del procedimiento sistemático del análisis (separación, purificación, preparación) de los ácidos nucleicos y las demás biomoléculas. A diferencia de otras moléculas biológicas, que pueden tener una carga positiva o negativa, en los ácidos nucleicos es aprovechado su carga negativa otorgada por los grupos fosfato presentes en ellos. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, al ánodo.

El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento generado por el campo eléctrico.

La electroforesis realizada en gel de agarosa es la forma más eficiente de separar fragmentos de ADN de tamaños variables que van desde 100 pb hasta 25 kb. La agarosa se aísla de los géneros de algas marinas Gelidium y Gracilaria, y consiste en repetidas aglomeraciones de agarobiose (L- y D-galactosa). Hervir el carbohidrato en agua y enfriar conduce a la formación de haces helicoidales de hebras de agarosa unidas entre sí por enlaces de hidrógeno (enlace no covalente). Los haces se asocian entre sí para crear poros que permiten el tamizado molecular de biomoléculas.

Antes de utilizar el método de electroforesis para la separación de los fragmentos de ADN (y ARN) el cual revolucionó las técnicas de separación, se utilizaba la centrifugación por gradiente de densidad, el cual presenta una desventaja frente a la nueva técnica, es que esta ultima solo proporciona datos aproximados del tamaño de los fragmentos utilizados. Para separar el ADN usando electroforesis en gel de agarosa, el ADN se carga en pocillos pre-moldeados en el gel y se aplica una corriente. El esqueleto de fosfato de la molécula de ADN (y ARN) está cargado negativamente, por lo tanto, cuando se coloca en un campo eléctrico, los fragmentos de ADN migrarán al ánodo cargado positivamente. Debido a que el ADN tiene una relación masa/carga uniforme, las moléculas de ADN se separan por tamaño dentro de un gel de agarosa en un patrón tal que la distancia recorrida es inversamente proporcional al log de su peso molecular.

La velocidad de migración de una molécula de ADN a través de un gel se determina por:

1) tamaño de la molécula de ADN

2) concentración de agarosa

3) Conformación de ADN

4) tensión aplicada (voltaje)

5) presencia de bromuro de etidio,

6) tipo de agarosa

7) tampón de electroforesis.

Después de la separación, las moléculas de ADN se pueden visualizar bajo luz UV previamente habiendo sido sometidos a una tinción, y es de uso frecuente el bromuro de etidio, que se intercala entre las bases de acido nucleico.

OBJETIVOS FUNDAMENTALES

MARCO TEORICO

La electroforesis es un método físico usado para separar moléculas ionizadas en un campo eléctrico de acuerdo a su carga y tamaño de la molécula, en un tampón de pH especifico.

Principales factores de migración

Principio de la migración: la velocidad de migración está en función de varios y esenciales parámetros:

V = E x Q/r x 1/h

Donde:

V: velocidad de migración

E: potencia de campo eléctrico (potencial de gradiente)

Q: carga eléctrica

h: viscosidad del medio

r: radio de molécula

1. Características moleculares: carga, forma, peso molecular
2. Características del medio:

1. Potencia iónica del medio: la conductividad es proporcional a la potencia iónica. La velocidad de migración de las moléculas es inversamente proporcional a una potencia iónica:

• En tampones altamente concentrados (potencia iónica alta) las bandas tienden a tener una forma bien definida mientras que la distancia de migración tiene a ser corta, separándose así pobremente las fracciones. 
• Inversamente en tampones diluidos (potencia iónica baja) la velocidad de la migración tiende a ser rápida y las bandas difusas.
• Porque la corriente es proporcional a una fuerza iónica, es importante verificar la corriente de inicio.

1. temperatura del tampón y temperatura ambiente:

Cuando la T° del tampón o T° ambiente es mayor de los 30° la distancia de la migración será larga y las fracciones serán difusas.

1. volumen del Tampón

La potencia del campo eléctrico (potencial gradiente) está definida como:

E = V/L

Donde:

V: potencial diferencia entre los dos electrodos

L: distancia entre los dos electrodos

La velocidad de migración es proporcional a la gradiente potencial.

1. pH del Tampón

El pH determina la carga de la molécula de las proteínas.

A un pH alcalino, las moléculas son cargadas negativamente y migran del cátodo al ánodo.

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