Electroforfesis

                   Práctica # 4. Electroforesis en Geles de Poliacrilamida en Condiciones Desnaturalizantes SDS-PAGE.[pic 1]

                       Universidad Autónoma de Ciudad Juárez-Instituto de Ciencias Biomédicas

                       Licenciatura en Químico Fármaco Biólogo-Laboratorio de Enzimología

                      Luis Enrique Javier Torres -Matricula: 122790

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas en una mezcla de un campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga: masa. Por ejemplo, si dos moléculas tienen masa y formas iguales, la de mayor carga neta se desplazara más rápido hacia un electrodo.

Dado que muchas proteínas o ácidos nucleicos de tamaño y forma diferentes tienen relaciones carga: masa casi idéntica. La electroforesis de estas macromoléculas en solución se traduce en muy escasa o nula separación. No obstante, es posible lograr la separación de proteínas y ácidos nucleicos mediante electroforesis en distintos geles (suspensiones semisólidas en agua) en lugar de hacerlo en soluciones liquidas. La separación electroforética de proteínas se suele efectuar en geles de poliacrilamida. Cuando una mezcla de proteínas se aplica a un gel y se le pasa una corriente eléctrica, las proteínas más pequeñas migran más rápido a través del gel que las proteínas más grandes.

La albúmina: es una de las proteínas que se encuentran en mayores cantidades en la sangre de una persona (la podemos encontrar en el plasma). De hecho, esta sustancia forma más de la mitad del plasma sanguíneo. La albúmina es especialmente importante para una persona por el hecho de que le permite mantener la presión osmótica del compartimiento vascular (presión oncótica o coloidosmótica) en rangos adecuados.

La hemoglobina es una hemoproteína de la sangre, de masa molecular de 64.000 g/mol (64 kDa), de color rojo característico, que transporta el oxígeno desde los órganos respiratorios hasta los tejidos, el dióxido de carbono desde los tejidos hasta los pulmones que lo eliminan y también participa en la regulación de pH de la sangre, en vertebrados y algunos invertebrados.

La lisozima, también llamada muramidasa, es una enzima de 14,4 kilodalton que daña las células bacterianas catalizando la hidrólisis de las uniones beta 1,4 entre los residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano. La lisozima es abundante en numerosas secreciones como la saliva, las lágrimas y el moco. Está presente también en los gránulos citoplasmáticos de los neutrófilos polimorfonucleares PMN.

La leche de vaca contiene más de 40 proteínas y todas ellas pueden actuar como alérgenos. Las principales son las Caseínas, Beta-lactoglobulina, Alfa-lactoglobulina y Seroalbúmina.  

Objetivo: Conocer los principios y aplicaciones de la electroforesis

Metodología:

1. Preparación del gel de corrimiento:

La preparación del gel de  separación se efectúa de acuerdo a la siguiente tabla:

Tabla 1. Preparación del gel de corrimiento.

Una vez polimerizado en el portagel, se lavó y se eliminó el exceso de agua usando tiras de papel whatman para después preparar el gel de concentración que se preparó de acuerdo a la siguiente tabla:

1. Preparación del gel de concentración ( stacking gel):

Tabla 2. Preparación del gel de concentración.

Una vez listo este gel se llenó la cámara, y se le coloco el peine evitando la formación de burbujas, y se procedió a polimerizarlo, ya listo se lavó con agua destilada. Después se colocó 4 µL de buffer de carga en papel parafilm en forma de gotas separadas entre sí aproximadamente por .5 cm, aunado a esto se agregó al buffer 15 µL de cada muestra (huevo, sangre, albumina, lisozima, y leche), una vez puestas las muestras se subió el volumen de la pipeta para resuspender y posteriormente colocar las muestras en los carriles correspondientes del gel. Ya listo todo se fijaron las condiciones de corrimiento que fue primero de 60 V hasta que la muestra entro en el gel de separación, después de esto se cambió a 115 V. Ya pasado el tiempo que fueron aproximadamente 1 hora: 40 minutos se procedió a desprender el gel cuidadosamente de los vidrios del gel y se tiñó usando Coomasie Blue usando el siguiente procedimiento:

1. Tinción de poliacrilamida por Commassie Blue:

Primero se sumergió el gel por 10 minutos en la solución A solución de fijado y se procedió a teñir con la solución de Commassie, ya teñido de destiño con la misma solución A (Metanol 50%, Ac. Acético 10%)  hasta observar las bandas y se enjuago con agua destilada.

Con los resultados obtenidos se procedió a calcular el peso molecular de las proteínas problemas

1. Para la determinación de aparente masa molecular de las proteínas:

Primero se mide la distancia total del principio al fin del gel de corrido, después  se debe medir la distancia del origen a cada uno de los estándares de peso molecular, para posteriormente medir  la distancia de la proteína desconocida (X) .Ya listo lo anterior para cada banda  se calcula la movilidad relativa: a / total, b /. Se calcula el logaritmo del peso molecular de cada estándar. Se hace una gráfica del log pM contra la movilidad relativa de los estándares  y en esta se debe localizar la movilidad relativa de la proteína de la proteína desconocida, extrapolando el log PM correspondiente y calcular el antilogaritmo.

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