HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

ANTECEDENTES:

La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus colaboradores en 1985 ha revolucionado la biología molecular y la medicina molecular (Saiki et al., 1985). La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica in vitro utilizada para amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes solo podían obtenerse cantidades mínimas de un gen específico, ahora incluso un único ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un millón de ejemplares en tan solo unas pocas horas.

Las técnicas de PCR se han hecho indispensables para muchos procedimientos comunes, como la clonación de fragmentos específicos de ADN, la detección e identificación de genes para diagnóstico y medicina legal, y en la investigación de modelos de expresión de los genes. Más recientemente, la PCR ha permitido la investigación de nuevos campos, como el control de la autenticidad de los alimentos, la presencia de ADN modificado genéticamente y la contaminación microbiológica.

Para comprender los principios de la PCR y sus aplicaciones, debe atenderse en primer lugar a la naturaleza de la molécula del ADN, por lo que en la sección siguiente se describen la estructura y la replicación del ADN.

El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que contiene a la molécula. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno; por tanto, y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos, dicha energía se traduce en una mayor temperatura. El %GC no es igual para todas las especies, es más, el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de ADN, según qué tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mit.

En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo northern, para uniones ADN-ARN.

La técnica de blotting (transferencia) se basa en la transferencia de bandas de ácidos nucleicos o proteínas desde un gel hacia una membrana de nitrocelulosa. Esto permite identificar La presencia de una banda por electroforesis

La electroforesis permite la separación ya sea de proteína o ácidos nucleicos en un gel. Cuando se trata de proteínas se utiliza un gel de poliacrilamida mientras que para los ácidos nucleicos uno de agarosa.

Cuando lo que se intenta identificar es DNA, se denomina Southern Blot, para esto se utilizan moléculas de DNA marcadas con radioactividad y que tengan una secuencia conocida y se identifican así las bandas de gel que contienen secuencias complementarias a la muestra.

Si se trata de RNA, se denomina Northern Blot, para esto se utilizan moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida y se identifican también las bandas de gel que contengan las secuencias complementarias a la muestra.

A finales de los años 80 cuatro científicos, Stephen Fodor, Michael Pirrung, Leighton Read y Lubert Stryer desarrollaron una revolucionaria tecnología para la determinación y cuantificación de ADN en una muestra. Esta tecnología desembocaría posteriormente en la primera plataforma de microarrays de ADN, denominada entonces GeneChip de Affymetrix.

La principal ventaja de esta novedosa tecnología frente a los métodos tradicionales (Northern, Southern, etc.), residía en la alta densidad de integración (cantidad) de material biológico que se consigue inmovilizar, es decir, la posibilidad de analizar simultáneamente miles de genes.

Actualmente esta tecnología se está aplicando entre otros al análisis de la expresión génica, detección de mutaciones y polimorfismos, secuenciación, seguimiento de terapia, medicina preventiva, screening y toxicología de fármacos, y diagnóstico molecular.

PCR (Reacción En Cadena De La Polimerasa)

Definición:

El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma: partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde. Ahora bien, ¿cómo tiene lugar esta reacción? Como veremos a continuación los cambios de temperatura constituyen la base para que se completen los pasos necesarios. El proceso se lleva a cabo en tres fases: desnaturalización, hibridación y elongación.

En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que las dos cadenas de DNA se separen. Esta primera fase se conoce como desnaturalización y se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC. El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde. Esta segunda fase se conoce como hibridación. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60ºC.

Por último, en la fase de elongación o extensión, la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región en que han hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la temperatura de elongación suele ser de 72ºC.

Estas tres fases constituyen un ciclo de la PCR. ¿Qué se ha obtenido tras un ciclo de PCR? Únicamente una copia de un pequeño fragmento del DNA molde. En este primer ciclo, los fragmentos generados no tienen el mismo tamaño: la copia de cada una de las cadenas se inicia, a partir del extremo 3’, en el punto en el que el cebador hibrida con el DNA molde y termina en el momento en el que la enzima polimerasa no es capaz de añadir más nucleótidos (es decir, que la nueva cadena formada no tiene un tamaño definido).

Entonces, ¿cómo se limita el tamaño de los fragmentos generados? La PCR se completa repitiendo entre 25 y 35 veces las tres fases descritas previamente, es decir, realizando entre 25 y 35 ciclos. Si se analiza lo que sucede a partir del primer ciclo se comprueba que tras varios

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