TCID50

Para obtener el título viral por la técnica de TCID50 o DICC50 empleamos dos métodos estadísticos, empecemos por el método de Reed-Muench y Spearman-Karber.

Recordemos que ustedes montaron un sistema formado por diferentes diluciones de su virus y una concentración constante de células. Para cada dilución se ocuparon 4 replicas, es decir, infectaron 4 pozos por cada dilución.

Lo que fueron haciendo:

1. De su stock viral hicieron 3 diluciones; 10-1, 10-2 y 10-3
2. De la dilución 10-3 tomaron una alícuota de 100 mL y la pasaron a los primeros 4 pozos de la hilera 1 que de igual forma ya contenía 100 μL de medio de mantenimiento.
3. Homogenizaron el volumen de esos primeros pozos y transfirieron 100 μl a los siguientes 4 pozos de hilera 2 y así sucesivamente. Realizaron diluciones con factor de 2.

Queda claro entonces que la dilución final acumulada en los primeros 4 pozos de la hilera 1 fue 1:2000, por lo tanto las siguientes son 1:4000, 1:8000, 1:16000 y así sucesivamente hasta los últimos 4 pozos.

Después realizaron lecturas de esas placas buscando la presencia o ausencia de ECP, lectura que hicieron cada 24 h. En cada lectura registraron cuantos pozos del total de infectados presentaban ECP, si los 4 presentaban ECP registraban 4/4, si eran 3 con ECP registraban 3/4, etc. La siguiente tabla es la que llenaban, la lecturas en este tipo de ensayo se deben detener cuando la presencia o ausencia de ECP se mantenga constante de una lectura  a la siguiente.

[pic 1]

Hasta aquí ya tenemos 3 datos importantes, la dilución con la que iniciamos el sistema, el factor de dilución y el volumen de transferencia o alícuota en el sistema.

Ahora bien, en la siguiente tabla ustedes ya pueden llenar las primeras 3 columnas (log de la dilución, número de pozos infectados y número de pozos sanos).

Tengamos presente en este método se busca encontrar la dilución de virus con la cual la mitad o el 50% de la población (en este caso los pozos infectados) resulta infectada.

Sabemos que, en un método estadístico entre más grande la población o la n muestral, los resultados resultan más confiables o significativos, esto considerando que las variables que pueden afectar nuestros estudio son las mínimas. En nuestro sistema, usamos una población de 4 individuos por dilución, es decir, 4 pozos infectados, a efectos de aumentar nuestra población o n, debemos obtener el dato de los acumulaos referentes al efecto que buscamos.

Usemos la tabla B como ejemplo

[pic 2]

1. Observen que los acumulados infectados se comienzan a sumar de abajo hacia arriba, vemos que en la diluciones 9 y 10 del virus ya no hay ECP, en la dil 8 hay un pozo con ECP, por lo tanto el acumulado hasta aquí es 1, si nos subimos a la siguiente dil (la 7) vemos un pozo con ECP, a esta le debemos sumar el ECP que se presentó en la dil 8, por lo tanto el acumulado ya es 2, el valor anterior se lo sumamos al número de pozos infectados de la dil 6 resultando 5 el valor acumulado y así sucesivamente. Esto quiere decir que, si en una dil de virus encontramos un número X de pozos infectados, en una dil anterior del virus se encuentra el número de pozos infectados propias de esta dilución más los pozos infectados de la dil que le sigue. Ocurre lo contrario para sacar el valor de los acumulados sanos, en esta columna empezamos a sumar de arriba hacia abajo y seguimos la misma lógica, si una dil encontramos x número de sanos, en una dil más grande encontraremos más x número de sanos.
2. La proporción de infectados/sanos la sacamos con la siguiente relación (acumulados infectados) / (acumulados infectados + acumulados sanos).
3. El % de infectados es el resultado de la relación anterior.

Si buscamos la dil de virus donde el 50% de la población resulte infectada, al observar la tabla nos damos cuenta que esta dilución se encuentra entre las dil 6 y 7, es decir, entre el 62.50% y el 25.00%.

Para poder obtener el valor al 50% debemos calcular la distancia proporcional entre la dilución que mostró >50% de infectados y la dilución que mostró <50% de los infectados, el valor de esta distancia proporcional se obtiene con la siguiente:

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