Trancriptaza

Transcriptasa inversa

Es una enzima que se utiliza para generar ADN complementario a partir de una planilla de ARN, un proceso denominado transcripción inversa.

La transcripción reversa es necesaria en la replicación de los virus, por lo cual los inhibidores de la RT se utilizan como fármacos antirretrovirales.

La RT fue descubierta por Howard Temin. En 1970 fue aislada de forma independiente por David Baltimore.

Estructura

Consiste en una ADN polimerasa dependiente de ARN y ADN-polimerasa dependiente de ADN, que trabajan juntos para llevar a cabo la transcripción.

Función en la replicación de los virus

Los virus de ARN utilizan la RT en su genoma para el paso de ARN en ADN, que se integra en el genoma huésped y se replica junto con el. Un ejemplo de estos virus es el VIH que afecta a los seres humanos.

Proceso de RT-PCR

La técnica de RT-PCR se utiliza para la detección y amplificación de ARN.. Debido a que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de realizar la PCR. La transcripción reversa genera una copia de la hebra de ARN, pero esta copia es ADN complementario (ADNc) el cual es estable al calor y puede resistir la metodología de la PCR.

Pasos de la RT-PCR:

-Se extrae el ARN total de la célula a estudiar, posteriormente se purifica el ARNm.

-Se une el cebador a la secuencia de ARN objetivo.

-Se utiliza una ADN polimerasa (rTth ) que cataliza la extensión del cebador, con la incorporación de nucleótidos complementarios.

-Se obtiene la hebra del ADNc complementario al ARN.

-Se realiza la amplificación por PCR.

Tipos de primers

Primer de secuencia específica (SSP)

Ofrece la mayor especificidad, pero no ofrece la flexibilidad de el oligo dT y los cebadores al azar, por lo que debe realizarse una nueva reacción de síntesis de cDNA para cada gen a estudiarse.

Oligo dT

DNA sintético compuesto por 15 nucleótidos con base timina. Es complementario a la terminación poliadenilada presente en el RNAm de organismos eucariotas.

Primer al azar

Son ideales para sintetizar grandes cDNA y para RNA no poliadenilado, como RNA bacteriano, debido a que hibridan a lo largo de la molécula diana. Empleando una combinación de primers al azar y oligo dT en la misma reacción de síntesis de ADNc de primera cadena puede mejorar la calidad mediante la combinación de sus beneficios.

RT comerciales

M-MLV RT (RT del Virus de la Leucemia Murina de Moloney)

Es una ADN polimerasa dependiente de ARN. Se puede utilizar en la síntesis de ADNc con ARNm largo (>5kb) como planilla. Es la preferida para ARNm largos, debido a que su actividad de RNasa H es más débil que la comúnmente utilizada AMV RT.

AMV RT (RT del Virus de la mieloblastosis aviar)

Cataliza la polimerización de ADN utilizando ADN molde, ARN o híbridos ARN:ADN. Requiere un cebador, así como Mg2 + o Mn2 +. La enzima posee una actividad RNasa H intrínseca. Los detergentes no iónicos y compuestos de sulfhídrilo estabilizan la actividad de la enzima in vitro.

ImProm-II ™

Permite la síntesis completa de cADN de longitud completa.Se puede utilizar para El ImProm-II ™ la transcriptasa inversa se puede utilizar para la transcripción inversa del ARN total, poli (A) + ARNm o plantillas de ARN transcrito sintéticos.

SuperScript®

Ofrece los niveles más altos de termoestabilidad y una vida media más larga a 50o C. Su alto rendimiento a altas temperaturas permite la RT de ARN con estructura secundaria. Debido a su reducida actividad RNasa H, produce ADNc de longitud completa, para una representación más completa de ARN.

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