Transportadores de Zn2+ en células de mamífero

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Transportadores de Zn2+ en células de mamífero

Integrantes: Basthian Mancilla - Maximiliano Mestre

Asignatura: Cinética, Bioenergética y Transporte

Docente: Juan G. Reyes

Fecha: 04.07.22

Introducción:

El Zinc, es partícipe de importantes procesos bioquímicos en las células de mamíferos, posee desde funciones estructurales a funciones catalíticas e interacciones proteicas.

El Zinc es un componente indispensable para la función normal de más de 300 enzimas catalíticas, estructurales y de regulación. También participa en la expresión génica, el metabolismo de DNA y RNA, síntesis de proteínas y en la unión de algunas hormonas a sus receptores. Es fundamental para mantener la estructura de las proteínas, crecimiento, maduración sexual, fertilidad, metabolismo de vitamina A, metabolismo de hormonas, respuesta inmune, cicatrización de heridas, sentido del gusto y del apetito.

El Zn de la dieta humana es absorbido en el intestino delgado a través de un proceso transcelular, el yeyuno (parte del intestino delgado en mamíferos) es donde se produce la mayor velocidad de transporte. La absorción es un proceso activo y saturable,aumenta la velocidad de transporte cuando el Zn se encuentra depletado. El Zn es un micronutriente generalizado dentro del organismo, su excreción se realiza principalmente por vía gastrointestinal (secreciones pancreática, intestinal y biliar) su absorción es esencialmente a nivel intestinal (enterocito). Desde el intestino es transferido a la circulación unido mayoritariamente a la albúmina (70%) y a la alfa 2 macroglobulina (20-40%). La absorción de Zn dietario depende de su estado nutricional, cantidad de inhibidores y favorecedores dietarios de su absorción e integridad del intestino. Mientras los fitatos y la fibra forman compuestos de baja solubilidad con el zinc, inhibiendo su absorción, la histidina, metionina y cisteína la favorecen.

Se han identificado diferentes transportadores de zinc localizados en membranas celulares. Estos transportadores difieren en su especificidad tisular, localización intracelular, sentido del transporte de zinc (intra o extracelular), tipo de expresión (regulada o constitutiva) y sensibilidad al zinc. Existen 10 transportadores de zinc en los mamíferos ZnT-1 hasta ZnT-10. El ZnT4 es el transportador específico a nivel intestinal, también se encuentra a nivel de glándulas mamarias. Se postula que además de estos transportadores de zinc, el DMT1 ubicado en el enterocito podría ser responsable de capturar e internalizar el zinc en la célula. (Cousins, R. J., Liuzzi, J. P., & Lichten, L. A. 2006).

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        Tabla 1: ubicación intracelular de transportadores de Familia Zn y Zip

Metodología de medición del transporte:

Se desconoce el mecanismo del transporte mediado por ZnT, pero se ha reportado que tanto ZNT10, ZIP8, y ZIP14 juegan un papel importante en el transporte de Manganeso (Fujishiro, H., & Kambe, T. 2022)

Para la medición de parámetros sobre estos canales se hacen cultivos in vitro en presencia o ausencia de Zn en ambientes controlados y parámetros ajustados para medir selectividad de iones, inhibición, etc

también la purificación y cristalización de estos complejos transportadores fue crucial para la identificación de la forma espacial y también posibles sitios de unión para transporte antiporte

Se desarrolló una determinación de la selectividad de los metales utilizando mediciones directas de la captación de metales en los proteoliposomas mediada por proteínas YiiP purificadas y reconstituidas. El espectro de sustratos metálicos YiiP se perfiló mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), lo que demuestra que YiiP transportó Zn (II) y Cd (II), pero rechazó todos los demás iones de metales de transición en el cuarto período . Este perfil de selectividad para el YiiP purificado en el tubo de ensayo es idéntico al de un solo mutante de cisteína YiiP en la membrana plasmática nativa de E. coli

El análisis ICP-MS de ZIPB en proteoliposomas reconstituidos proporcionó evidencia directa de que ZIPB transporta Zn(II) y Cd(II), pero rechaza Fe(II), Cu(II), Co(II), Mn(II) y Ni (II) (31). Por lo tanto, ZIPB comparte una selectividad de metal común con YiiP. El zinc y el cadmio son dos metales del bloque d del grupo 12 en el cuarto y quinto período, respectivamente. Tienen configuraciones electrónicas externas similares pero varían en sus radios iónicos. Parece que se aprovechan las características comunes en las configuraciones electrónicas de Zn(II) y Cd(II). (Kambe, T., Taylor, K. M., & Fu, D. 2021).

 Propiedades cinéticas.

Los análisis cinéticos de flujo detenido de YiiP (cristalizado) y una segunda proteína CDF de E. coli, ZitB, revelaron un proceso de transporte saturable de sustrato que puede ajustarse mediante la ecuación de Michaelis-Menten . Este comportamiento cinético indica un proceso de dos pasos iniciado por un enlace Zn(II)/Cd(II) seguido de un cambio conformacional de la proteína para mover el ion metálico unido a través de la membrana. La unión de Zn(II)/Cd(II) alcanza rápidamente un estado estacionario mientras que el cambio conformacional resultante constituye un paso limitante de la velocidad de la reacción de transporte. En un entorno experimental con una concentración de Cd(II) en equilibrio a través de la membrana, la aplicación de flujo detenido de un salto de concentración de protones provocó un flujo de Cd(II) en oposición al gradiente de protones impuesto, mientras que los protones en el tampón de reacción se agotaron por completo. El transporte de Cd(II) está estancado a pesar de la imposición de un gradiente de Cd(II) . Estos resultados demostraron claramente un mecanismo antipuerto acoplado a protones obligatoriamente. Se encontró que la estequiometría de intercambio de Cd (II) por protones era 1: 1 por flujo. Por lo tanto, la cinética de transporte de Michaelis-Menten observada puede explicarse mediante un modelo de acceso alternativo de un solo sitio , de acuerdo con la observación de un solo sitio de transporte tetraédrico en la estructura cristalina de YiiP (Chao, Y. y Fu, D. 2004)

En estudios de epitelio intestinal se realizó un medio compuesto por las sales Cloradas de Na+ y K+, con glucosa y tamponada con Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico. De ahí la probable presencia de complejos de Zn2+ con Cl (y OH). También estas células epiteliales fueron sometidas a estudios de cultivos en filtros para estimar la captación en el lado apical y basolateral de la monocapa celular. Sus resultados sugieren la probable existencia de unión extracelular a las membranas apicales y captación en el  presente lado apical de un componente saturable [la concentración de Zn”+ para absorción semimáxima (Kt) = 41 uM y velocidad máxima (Vmax) = 30 pmol* cm^2* min -1 pero no en el lado basolateral. La adición de Cys y His a la el lado apical no modificó la captación. Sin embargo, debido a que la concentración de Zn2+ libre debería haber disminuido en >80% por la adición de His o Cys, de hecho, los datos podrían interpretarse como la posible estimulación de la captación de Zn2+, ya sea mediante la incorporación del transporte de una especie Zn 2+-His o Zn 2+-Cys  o la activación de otros mecanismos de transporte de Zn 2+ (Reyes, J. G. 1996)

La componente saturable presenta valores de  Kt y Vmax desde 0,22 mM y 17,2 nMol*min-1 *mg de proteína -1, respectivamente. En esta preparación La adsorción de Zn2+ no parece estar impulsada por la membrana potencial. Ningún efecto de HCO3 fue observado y sus datos de adsorción de Zn2+ en presencia de tiocianato sugieren el probable transporte de Zn2+-SCN(complejos) en esta condición. Cd”+, un ion con propiedades enlazantes  similares al Zn2+, inhibe competitivamente la absorción de Zn 2+. Tanto la cinética como la competencia por Cd”+ en este paso sugiere un sistema de transporte mediado. (Reyes, J. G. 1996)

El nivel de zinc en el suero humano (>10 μM) es de muchos órdenes de magnitud mayor que el punto de ajuste homeostático de las concentraciones de zinc libre citosólico en células de mamíferos. Este imponente gradiente de zinc es mantenido por una multitud de transportadores de zinc de mamíferos y proteínas amortiguadoras de zinc intracelulares. Hasta ahora, las mediciones en celdas del transporte de zinc por varios ZIP de mamíferos han mostrado un proceso consistente de saturación de sustrato con la cinética de estado estacionario de Michaelis-Menten. Dichos comportamientos cinéticos parecen consistentes con un modelo de acceso alternativo de un solo sitio, pero se requieren estudios funcionales más rigurosos de proteínas purificadas en un entorno experimental bien definido para definir inequívocamente el mecanismo de transporte para los ZIP de mamíferos. (Cousins, R. J., Liuzzi, J. P., & Lichten, L. A. 2006).

 Características moleculares del sistema de transporte y su operar.

En mamíferos monogástricos, la absorción del Zn tiene lugar principalmente en el intestino delgado.  En Lee et al. (1989) se investigó la interacción entre la absorción intestinal de zinc y otros solutos utilizando la técnica de perfusión de estado estacionario de triple lumen estableciendo así que la absorción de Zn suministrado de forma oral en humanos se da en la parte proximal del intestino delgado, particularmente en el yeyuno y de manera secundaria en el duodeno. Por otra parte la capacidad de absorción de Zn del colon de rata es al menos tan alta como la de regiones más proximales. En rumiantes establecieron que  el intestino delgado es también el principal sitio de absorción,  mientras que  para determinar la absorción de zinc por los tejidos ruminales del cordero, se ha estipado post administración oral y por vía intravenosa, donde la absorción del tejido rumial fue considerablemente superior a la de los tejidos abomasal, duodenal o intestinal., trabajos modernos demostraron que si bien el Zn es tomado por los epitelios ruminal y omasal, no parece existir un pasaje más allá de la serosa.(Seal y Mathers, 1989).

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