OMC Seattle

Usos y/o Aplicaciones

La Reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (test de paternidad) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado.

1. Desnaturalización

Se desnaturaliza el ADN, es decir se separan las dos hebras de las cuales está constituido. Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la forma más habitual. Puesto que los enlaces del hidrógeno que unen las bases de uno a otro son débiles, se rompen a altas temperaturas, mientras que los enlaces entre fosfatos y desoxirribosa, que son enlaces covalentes más fuertes, permanecen intactos. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma.

2. Alineamiento (Unión de la sonda a la secuencia diana)

El objetivo no es replicar la hebra entera de ADN sino replicar la secuencia diana de aproximadamente 100-600 pares de bases que es única en el organismo.

Los primers o iniciadores marcan el final de la secuencia diana: éstos son sintéticos y cortos, creados a partir de una hebra única de ADN y que normalmente constan de 20-30 bases, con una marca de biotina 5’ al final para ayudar a la detección.

Temperatura de Alineación: generalmente ocurre entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud y la secuencia de bases de los iniciadores. Permite que éstos se unan a la secuencia diana con alta especificidad.

3. Extensión de la cadena

Por último actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del primer como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72 ºC, temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su máximo de actividad, aumentando exponencialmente la cantidad de fragmentos de ADN amplificados en la reacción.

Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la cadena a la temperatura óptima de la ADN polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su conservación.

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