Celulas Esplenicas

ANNA V. VÁZQUEZ M.*, LUZ PÉREZ RIVERA*, PATRICIA A. GALLEGOS V.*, MARIO C. SALINAS CARMONA*

ocardia brasiliensis es el principal agen- te causal del actinomicetoma en México,1 el micetoma es una enfer- medad infecciosa crónica de la piel y tejido celular subcutáneo que en ocasiones se ex- tiende al músculo, a los huesos y a los órganos adyacentes. En nuestro medio, usualmente, afec- ta a las extremidades inferiores.2,3 El micetoma granulomatosa crónica se carac- teriza por una inflamación persistente, con áreas de abscesos múltiples donde pueden encontrarse microcolonias del agente causal llamados gránu- los o granos macroscópicamente visibles, de alre- dedor de 1 mm de diámetro, colores variables y células inflamatorias que rodean las colonias mi- croscópicas del organismo infectante.2,4 La defen- sa del huésped contra la infección de microorga- nismos intracelulares depende, críticamente, de la presencia, funcionalidad e integridad de los fagocitos mononucleares (MO). Los macrófagos eliminan la mayoría de las nocardias mediante la fagocitosis. En particular, esas células son elemen- tos centrales, tanto en la respuesta innata como en la respuesta adoptiva a la invasión microbiana.2 Estudios realizados por Krick et al.5 y Melendro, en México, propusieron que la inmunidad no es- pecífica mediada por macrófagos confiere resisten- cia cruzada en ratones infectados con gérmenes

intracelulares, como la Listeria monocytogenes o Toxo- plasma gondii.6 Por otra parte, se sabe que macrófagos de dis- tintos sitios anatómicos difieren en sus interac- ciones con la nocardia. Y células de Kupffer de ra- tones no inmunizados muestran capacidad menor para la fusión fagosoma-lisosoma y permiten el crecimiento de cepas de nocardia de virulencia mayor e intermedia, en tanto que los macrófagos de peritoneo y de bazo muestran capacidad ma- yor para fagocitar las células microbianas en la fu- sión fagosoma-lisosoma.2 En la defensa del huésped contra las infeccio- nes por microorganismos intracelulares, entre és- tos la nocardia, se han propuesto como esencia- les tanto los efectores de la resistencia innata como los de la inmunidad adquirida específica.7 En el caso de los microorganismos patógenos intracelu- lares como Listeria, mycobacerium, Salmonella y Nocardia, la contribución de la inmunidad celu- lar (LT) en el control de la infección se ha estudia- do. En el caso de las infecciones con LVS, el ra- tón atimico muere en la primera semana de infec- ción. Sin embargo, en otros experimentos realiza- dos con Salmonella y Listeria, se observó que el

LLaa ttrraannssffeerreenncciiaa ppaassiivvaa ddee ccéélluullaass eesspplléénniiccaass ddee LLaa ttrraannssffeerreenncciiaa ppaassiivvaa ddee ccéélluullaass eesspplléénniiccaass ddee La transferencia pasiva de células esplénicas de rraattoonneess iinnmmuunniizzaaddooss ccoonn rraattoonneess iinnmmuunniizzaaddooss ccoonn ratones inmunizados con N. brasiliensis N. brasiliensis N. brasiliensis N. brasiliensis N. brasiliensis eevviittaa eell eevviittaa eell evita el eessttaabblleecciimmiieennttoo ddee llaa iinnffeecccciióónn eessttaabblleecciimmiieennttoo ddee llaa iinnffeecccciióónn establecimiento de la infección

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control de la infección se lleva a cabo mediante la participación de la respuesta inmune humoral (cé- lulas B). En tales experimentos se demostró un efecto protector en la fase temprana de la respues- ta inmune humoral8 Debido a esto, Salinas-Car- mona y Pérez-Rivera9 demostraron que los anima- les inmunizados con antígenos solubles purifica- dos de N. brasiliensis,10,11 en forma activa y pasiva, solamente en los primeros días de la inmuniza- ción: 15 y 7, respectivamente, quedaban protegi- dos de la infección por N. brasiliensis Tales resultados concuerdan con Salinas-Car- mona y Torres-López,12 quienes mostraron que la transferencia pasiva de suero antibacterias muer- tas por calor confiere protección al transferirse a otro ratón que había sido infectado con Nocardia brasiliensis. Asimismo, en los resultados mostrados por Licón-Trillo et al.13 el suero antiproteasa obte- nido en los días 30 y 60 posinmunización prote- ge total y parcialmente a los animales que luego fueron infectados con N. brasiliensis, mientras que los sueros antiproteasa obtenidos en los días 90 y 120 no los protegen. El propósito de este estudio es investigar el papel que juegan las células mono- nucleares obtenidas del bazo de ratones inmunizados con antígenos de Nocardia brasiliensis, presentes específicamente en los días en los cuales se ha visto que hay protección para transferirlas a otros recipientes, y para observar el efecto de es- tas células sensibilizadas en el establecimiento y evolución de micetoma experimental causado por N. brasiliensis.

Materiales y métodos

Animales de experimentación

Se utilizaron 50 ratones BALB/c (hembras y ma- chos de 12 a 14 semanas de edad) con peso pro- medio de 20 g. Esta cepa la donó gentilmente el Dr. Hanson, de los Institutos Nacionales de Sa- lud (NIH, Bethesda Ma), en 1982, y se ha mante- nido en el Bioterio del Departamento de Inmu- nología. A los roedores se les proporcionó alimen-

to comercial (Purina de México S.A. de C.V.) y agua estéril Ad libitum.

Obtención de la cepa de N. brasiliensis

Se utilizó en este estudio la cepa N. brasiliensis HUJEG-1, obtenida en el Departamento de Der- matología del Hospital Universitario «Dr. José E. González» (UANL), de un paciente al que se le diagnosticó micetoma, registrada en el ATCC por el Dr. Mario C. Salinas C., con el número 700358, gracias a la confirmación realizada por June Brown.17 Esta bacteria se mantiene cultivada en Me- dio Agar Sabouraud a 37°C.

Obtención de la suspensión unicelular18

A partir de la cepa N. brasiliensis HUJEG-1, la cual se cultiva en Agar Sabouraud, se tomó con una asa bacteriológica un acumulo de colonias, y éstas se colocaron en 30 ml de medio de un cultivo e infusión de cerebro-corazón (BHI) contenido en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Posteriormen- te, se incubaron a 37°C con agitación durante 48- 72 hrs (Dubonoff Metabolic Shacking Incubator GCA/precisión Scientific) Las colonias hidratadas se colocaron en tubos cónicos de 50 ml (Falcón) con tapón de rosca y se centrifugaron a 2000 rpm por 10 min. Después de decantar el sobrenadante, se le agregó 10 ml de solución salina 0.85% y se colocó en un tubo cónico de 50ml, donde se trituró con un agita- dor de vidrio; luego se lavaron las bacterias con solución salina de 0.85%. Asimismo, se homogeneizaron (Potter-Evelham) y se obtuvo una suspensión bacteriana unicelular. Finalmente, a la suspensión bacteriana unicelular se le determinó UFC/ml (Miles y Misra) y se ajustaron a una con- centración de 10X 106/ml, utilizando 0.1 ml de esta suspensión para infectar a los ratones BALB/c.

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LA TRANSFERENCIA PASIVA DE CÉLULAS ESPLÉNICAS DE RATONES INMUNIZADOS CON N. BRASILIENSIS EVITA EL ESTABLECIMIENTO DE LA INFECCIÓN

Obtención y purificación de los antígenos solu- bles de N. brasiliensis (P24, P61 y proteasa)

A partir del extracto celular crudo de N. brasiliensis se obtuvo la masa bacteriana, la cual fue deslipidizada con una mezcla de etanol: éter; pos- teriormente, se hizo una extracción de proteínas con buffer Tris-acetato de magnesio 0.1 M pH 7.4. La proteína p24 se obtuvo mediante la precipita- ción de proteínas a 50% con sulfato de amonio saturado del extracto celular crudo; después de la precipitación se centrifugó y del sobrenadante fil- trado por sephadex G100 se obtuvo la proteínas P24, mientras que la P61 y la proteasa se obtuvie- ron a partir del precipitado mediante elusión me- cánica a partir de geles preparativos a 12%.

Inmunización de los ratones BALB/c con antíge- nos solubles de N. brasiliensis

Se utilizaron tres grupos de ratones de 10 cada uno, los cuales se inmunizaron con 20µg/0.1ml más 0.1 ml de AIF de la proteínas P24, P61 y proteasa, respectivamente. La inmunización se rea- lizó por vía sc., y los animales se sacrificaron a diferentes tiempos de ésta (45, 30, 15 y 7 días). A continuación, en condiciones de esterilidad, se obtuvo el bazo de los ratones, del cual se obtuvie- ron las células esplénicas que después se transfirie- ron a otros grupos de ratones BALB/c (receptores).

Transferencia pasiva de células mononucleares de bazo de ratones inmunizados con antígenos de N. brasiliensis

Las células MN obtenidas de los bazos de los rato- nes inmunizados con antígenos de N. brasiliensis a diferentes tiempos de inmunización (7, 15, 30 y 45 días posinmunización) se ajustaron a una con- centración de 100,000 células/0.1 ml, las cuales se transfirieron vía IP. Unas vez transferidas las células MN a los ratones BALB/c (receptores), in-

mediatamente se infectaron éstos con N. brasiliensis.

Infección con N. brasiliensis a los ratones BALB/ c (receptores) que recibieron las células MN de los ratones inmunizados con antígenos solubles con N. brasiliensis20

Todos los ratones transferidos pasivamente con las células MN provenientes de los ratones inmunizados con antígenos de N. brasiliensis; pos- teriormente, fueron infectados con 0.1 ml de una suspensión de N. brasiliensis, cuya concentración fue de 10X 106/1ml en el cojinete plantar. Des- pués de la infección con la bacteria, a los animales se les midió la inflamación del cojinete plantar con un vernier. Los resultados se graficaron en mm de

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