Hibridoma

Tecnología del Hibridoma

Los hibridomas son células híbridas resultantes de la fusión de células extraídas del bazo de un animal (linfocitos) con células cancerosas inmortales y de reproducción rápida (mielomas).

Esta técnica es utilizada para la producción de anticuerpos mono nucleados.

La respuesta normal en lo que concierne a anticuerpos a cualquier molécula que se ha introducido natural o artificialmente es compleja (policlonal) y da como resultado la formación de una mezcla de diferentes anticuerpos contra cualquiera de los sitios antígenos (pueden formarse anticuerpos contra azúcares, proteínas o lípidos o combinaciones de ellos).

-La primera fase en la producción de anticuerpos monoclonales (o mono nucleados) consiste en preparar el antígeno (seleccionando especificidades individuales mediante fusión celular), éstos son purificados parcialmente, vgr por disgregación sub-celular, lavado con un disolvente apropiado (elución) de bandas proteínicas a partir de geles de acrilamida o enriquecimiento cromotográfico.

Posteriormente, se inocula al animal en cuestión con los antígenos seleccionados, de suerte que cada linfocito produzca un anticuerpo específico; cada uno de ellos (normalmente mortal) es posteriormente, inmortalizado por la fusión con un mieloma. La célula resultante con una nueva carga genómica, guarda su especificidad en la producción de anticuerpos homogéneos (y únicos, de allí su denominación de anticuerpos monoclonales) al originar un clon de nuevas células, con la rapidez del mieloma.

El Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal para poder ser analizado para su utilización depende de la unión directa del anticuerpo con su antígeno, la cual no es fácil de detectar, por lo que se le adiciona un segundo anticuerpo marcado ya sea con una molécula fluorescente, un isótopo radiactivo, o con una enzima que posee un producto de reacción coloreada; de esta manera puede detectarse la unión de un anticuerpo monoclonal con su antígeno, una vez que la cavidad que contiene el anticuerpo deseado es identificada, las células tienen que clonarse para tener la certeza de que todas proceden de un sólo producto de fusión (lo que se logra reduciendo, por dilución, a una las células de cada cavidad para que cuando vuelvan a crecer los sobrenadantes de esos clones correspondan a un único origen), asegurado lo cual el producto se congela en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Aunque existen numerosas variantes para la obtención de hibridomas y Ac Mc específicos, el protocolo general tiene las siguientes etapas:

Clon de células específicas (Inmortalidad) 1. Como célula de mieloma parenteral se selecciona una mutante enzimo-dependiente de una línea celular de plasmocitoma. Habitualmente se usan células deficientes en hipoxantin-guanin-fosforribosil-transferasa (HGFRT-). Se cultivan en un medio que contiene dicha enzima.

Anticuerpos específicos (cel. bazo) 2. Las células parentales productoras de anticuerpos se obtienen del bazo (o de la población linfocitaria de sangre periférica) de un animal inmunizado con el antígeno frente a cuyos epitopes se desea obtener anticuerpos monoclonales. 3. Ambos tipos de células parentales se mezclan en poli etilenglicol durante 1 minuto. Se produce la fusión celular y se originan los hibridomas. 4. Tras un lavado y unas horas de incubación, se procede a la dilución y clonado de la suspensión celular, sub cultivando durante varias semanas en un medio desprovisto de HGFRT. Las células no fusionadas mueren en este medio y cada uno de los hibridomas da lugar a un clon. 5. Los sobrenadantes de cada clon celular son examinados periódicamente para determinar la presencia de anticuerpos frente al antígeno utilizado. Los clones identificados como productores de anticuerpos son clonados de nuevo, se comprueba su capacidad de producción, se establece la línea celular correspondiente y se determinan las características del Ac Mc obtenido.

La producción del Ac Mc se realiza por cultivo en masa de la línea celular o por inducción de un mieloma en un animal sin génico, en cuyo líquido ascítico la concentración del Ac Mc puede ser muy elevada.

En la actualidad se dispone de una amplia gama de líneas mielomatosas murinas para fusión de estas características (líneas NS1, SP2, 653, etc.).Se ha consagrado un gran esfuerzo a la consecución de adecuadas líneas de mieloma humano y, en general, a la producción de hibridomas con células humanas que sinteticen anticuerpos que puedan ser utilizados experimentalmente en el hombre. Aunque se consigue la fusión entre células mielomatosas de ratón y células humanas que expresen los caracteres de estas últimas, en general son poco estables.

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