Las células enteras

2,4 de célula entera INMUNÓGENOS

Las células enteras presentan una alternativa eficaz para la generación de anticuerpos a un antígeno en su forma nativa si se expresa normalmente en la superficie celular. Exógenos: expresión de una proteína de membrana, en una línea celular que es de la misma especie y cepa (si un ratón) que se utiliza para la producción de anticuerpos, esta debe resultar en una célula recombinante que es inmunológicamente reactivo aparte del antígeno recombinante expresado. Tal línea celular se espera que modifique después de la traducción del antígeno recombinante

18 Realización y Utilización de anticuerpos

Como la proteína nativa presenta el antígeno en la superficie celular en una conformación que es relevante. Vectores pCEP4 y pREP4 están diseñados para alto nivel, la expresión constitutiva ya sea del CMV o virus del sarcoma de Rous largo de repetición terminal de potenciador de promotores (Invitrogen). Ambos vectores son excelentes transitorios de alto nivel de expresión episomal en células de primates. Líneas estables de expresión pueden ser generadas por transfección con vector linealizado y la selección apropiada de fármaco. Otros vectores (por ejemplo, pcDNA, Invitrogen) están diseñados para la clonación rápida y la expresión constitutiva en una variedad de células de mamífero. Vectores que están disponibles a realizar diferentes marcadores de selección, con o sin proteínas de fusión marcados (6xHis y MYC), y con otras características, incluyendo la secreción de la proteína expresada o expresión inducible. Muchos vectores emplean el CMV potenciador-promotor de alto nivel expresión en muchas células de mamífero. Cuando el promotor de CMV no es óptimo, los vectores que emplean el promotor EF-1α humana o UBC puede ser seleccionado.

Independientemente de la elección del vector, el fragmento para ser expresada debe ser amplificada por PCR y clonado en el vector con la tecnología de ADN recombinante estándar. Siempre que sea posible, de larga duración genes deben ser clonados para asegurar el tráfico adecuado a la superficie celular, modificaciones post-traduccionales, y el plegamiento correcto. La adición de etiquetas a la proteína debe ser limitada a las regiones intracelulares para evitar los posibles efectos de la etiqueta puede tener sobre la conformación, y aún así proporcionar un epítopo para permitir detectar la proteina. Los vectores de expresión pueden ser introducidos en forma estable de mamífero células mediante técnicas que incluyen la coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación 6,7,8,9 y transfección con lipids10 catiónicos y los clones seleccionados para el vector integrado con los antibióticos apropiados. Las líneas celulares deben ser totalmente caracterizadas por la expresión apropiada de la proteína de la superficie celular, mediante análisis de transferencia Western y de flujo citometría cuando sea posible, antes de utilizarse como un inmunógeno de células enteras. Después de las líneas se establecen y se caracteriza, alícuotas se deben almacenar en nitrógeno líquido y se utiliza para reemplazar las culturas que muestran cualquier pérdida de expresión. Retrovirus proporciona un medio eficaz para el suministro de expresión de ADN único constructor de una amplia gama de tipos celulares de mamíferos, especialmente líneas celulares donde son no transfectadas fácilmente por otras técnicas. Los vectores retrovirales tienen la ventaja de que se integran en el genoma del huésped para permitir a largo plazo de la expresión estable

proteína recombinante. Aunque los vectores de retrovirus proporcionan una forma relativamente fácil de

suministrar genes de manera estable en células de mamífero, su uso requiere consideraciones especiales

y los protocolos son relativamente largo. El uso de vectores retrovirales requiere

adherencia a las guías estándar para garantizar la seguridad, que incluyen el uso de un bioseguridad

nivel II instalación de cultivo de tejido (EE.UU.), el uso de una campana de clase II de flujo laminar con filtro HEPA

filtro, y el rendimiento de trabajo en una zona de acceso limitado y con el uso de los

guantes dobles, batas de laboratorio, y la cara. Directrices para el uso de retrovirus puede

variar de acuerdo con la institución. Antes de usar cualquier sistema de expresión retroviral,

consulte con un oficial de seguridad institucional para los requisitos específicos de su instalación.

El laboratorio del Dr. Garry Nolan en la Universidad de Stanford ha desarrollado el

Phoenix sistema de administración retroviral, basada en el virus de leucemia murina de Moloney que

permite la entrega de genes a la mayoría de tipos celulares de mamífero divisorias. El sistema

viene ya sea como un sistema de envasado ecotrópica (capaz de suministrar genes a

dividir las células murinas o de rata) o un sistema de anfotrópico (capaz de entregar genes

Antígenos 19

para dividir las células de la mayoría de las especies de mamíferos, incluyendo seres humanos). Materiales, tutorías,

y protocolos para la construcción de vector retroviral, la producción viral, y estables

infección están disponibles a través del sitio web informativo Nolan laboratorio

(Http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral_systems/retsys.html). Retroviral

sistemas están disponibles comercialmente de Clontech (Mountain View, CA).

2.4.1

...