Técnica de Southern blot

Técnica de Southern blot

El concepto básico de la técnica de Southern la cual debe su nombre al científico que la desarrolló, Edward Southern. En términos simples esta técnica nos permite identificar y/o estudiar fragmentos de ADN purificado provenientes de una muestra biológica (donde se utilizan técnicas de hibridación molecular las cuales se basan en el estudio de secuencias de DNA y RNA tanto para su identificación como para su eventual cuantificación) separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nylon.

En términos generales la técnica comienza con el aislamiento y purificación del ADN de interés para después realizar una digestión enzimática utilizando endonucleasas de restricción para obtener fragmentos de ADN entre los que se hallará la secuencia de interés. Los fragmentos obtenidos la digestión enzimática son separados por electroforesis. Donde se obtiene la separación de los fragmentos según su tamaño.

Después se continua con la desnaturalización del ADN. Esta desnaturalización se realiza químicamente utilizando una solución alcalina en la que el gel de agarosa es sumergido e incubado durante un tiempo determinado y así los fragmentos de ADN que se encuentran en el gel se desnaturalizan para obtener ADN de cadena sencilla.

Se prosigue a realizar la transferencia de estos fragmentos del gel a un soporte sólido que suelen ser membranas de nitrocelulosa o de nylon. En este soporte quedan inmovilizados los fragmentos de ADN, donde la transferencia es necesaria para que pueda realizarse la posterior reacción de hibridación. La finalidad de la transferencia es crear una réplica exacta de lo que se tenía en el gel ahora un soporte mucho más sólido.

Teniendo los fragmentos de ADN movilizados ahora si se prosigue a realizar la hibridación. Para identificar el fragmento deseado de ADN se utiliza una sonda de ácido nucleico con una secuencia homóloga a la secuencia objetivo específicas marcadas, por ejemplo, con fósforo 32. La sonda se pone en contacto con la membrana de nitrocelulosa y en aquellos fragmentos donde la sonda encuentra su secuencia complementaria se pegará y este proceso es conocido como hibridación.

Una vez que se realiza la reacción de hibridación la marcación permite que la sonda sea visualizada en el Southern blot y de esta manera se habrán identificado secuencias de interés en el ADN manipulado.

Referencias

• Dra. Julia van Campen. (2023). Transferencia Southern. Genomics Education Programme. https://www.genomicseducation.hee.nhs.uk/genotes/knowledge-hub/southern-blotting/
• Genome.gov. (2024). ​Southern Blot . National Human Genome Research Institute. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Southern-Blot
• Thermo Fisher Scientific. (2024). ​Southern Blot . Thermo Fisher Scientific Inc. https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/nucleic-acid-gel-electrophoresis/southern-blotting.html

...