Vectores Para Ingenieria Genetica

Las células huésped y vectores

En el capítulo 4 vimos las herramientas necesarias para la construcción de ADN recombinante. Este proceso se lleva a cabo en el tubo de ensayo y produce moléculas recombinantes que deben ser tratados posteriormente para permitir la selección de la secuencia requerida.

Clonación de genes utiliza las características de los sistemas vivos para propagar moléculas de ADN recombinante; En esencia, esto puede ser considerado como una forma de agricultura molecular.

Hay tres cosas que tienen que hacer para aislar un gen de una colección de secuencias de ADN recombinante:

-- Las moléculas recombinantes individuales tienen que ser lugares separados unos de otros. ?

--Las secuencias recombinantes tienen que ser ed amplificación para proporcionar suficiente material para su posterior análisis. ?

--El fragmento especí fi co de interés tiene que ser seleccionado por algún tipo de método dependen de la secuencia.

En este capítulo vamos a ver en los primeros dos de estos requisitos, que en esencia representan los sistemas y técnicas implicadas en la clonación de genes. Esta es una parte esencial de la mayoría de los programas de manipulación genética. Incluso si el resultado deseado es un organismo transgénico, el gen a utilizar debe fi primer ser aislado y caracterizado, y por lo tanto se requieren sistemas de clonación. Algunos de los métodos utilizados para la selección de secuencias especí fi cos se describirá más adelante, en el capítulo 8.

La clonación de genes se logra mediante el uso de un vector (portador) para propagar la secuencia deseada en una célula huésped. La elección de la combinación huésped-vector de hecho es una de las etapas críticas de un procedimiento de clonación.

5.1- TIPO CELULAR ANFITRION.

El tipo de célula huésped utilizada para una aplicación particular dependerá principalmente de la finalidad del procedimiento de clonación. Si el objetivo es aislar un gen para el análisis estructural, los requisitos pueden requerir un sistema simple que es fácil de usar. Si el objetivo es expresar la información genética en una eucariotas superiores tales como una planta, se requiere un sistema más específico. Estos dos objetivos no son necesariamente excluyentes entre sí; a menudo un sencillo huésped primario se utiliza para aislar una secuencia que se introduce a continuación en un sistema más complejo para la expresión. Los principales tipos de célula huésped se muestran en la Tabla 5.1, y se describen en las siguientes secciones.

5.1.1 LOS HUÉSPEDES PROCARIOTAS

Una célula huésped ideal debería ser fácil de manejar y propagar, debe estar disponible como una amplia variedad de cepas genéticamente definidas de fi, y debe aceptar una variedad de vectores. La bacteria Escherichia coli tiene estos requisitos y se utiliza en muchos protocolos de clonación. E. coli se ha estudiado en gran detalle, y muchas cepas diferentes fueron aislados por los genetistas microbianos mientras investigaban los mecanismos genéticos de este organismo procariota. Estos estudios proporcionaron la información básica esencial sobre el que se basa la ingeniería genética. E. coli es una bacteria gram-negativa con un solo cromosoma PAC-ked en una estructura compacta conocido como el nucleoide. El tamaño del genoma es de unos 4,6 × 106 pares de bases, y la secuencia completa se conoce ahora. Los procesos de expresión génica (transcripción y traducción) están acoplados, con ser inmediatamente disponible para la traducción de los ARNm recién sintetizadas. No hay post-transcripcional modificacion del transcrito primario como se encuentra comúnmente en las células eucariotas. Por lo tanto, E. coli se puede considerar como una de las células huésped más simples. Gran parte de la clonación de genes que se realiza rutinariamente en los laboratorios implica el uso de E. coli anfitriones, con muchas cepas genéticamente diferentes disponibles para aplicaciones específicas. Además de E. coli, otras bacterias pueden usarse como huéspedes para los experimentos de clonación de genes, con ejemplos que incluyen especies de Bacillus, Pseudomonas, y Streptomyces. Hay, sin embargo, ciertos inconvenientes con la mayoría de estos. A menudo hay un menor número de vectores adecuados disponibles para su uso en tales células que es el caso de E. coli, y conseguir de ADN recombinante en la célula pueden causar problemas.

La bacteria Escherichia coli es la célula huésped procariota más comúnmente utilizado, con una amplia variedad de diferentes cepas disponibles para aplicaciones particulares.

Es, por lo tanto, a menudo más sensato para llevar a cabo un procedimiento inicial de clonación en E. coli, para aislar la secuencia requerida, y luego para introducir el ADN purificada en el host de destino. Muchos de los inconvenientes se pueden superar mediante el uso de este enfoque, particularmente cuando se usan vectores que pueden funcionar en el host de destino y en E. coli (vectores lanzadera). El uso de bacterias distintas de E. coli no se tratará más adelante en este libro; detalles se pueden encontrar en algunos de los textos mencionados en la sección Lecturas recomendadas.

5.1.2 ANFITRIONES EUCARIOTAS

Una desventaja del uso de un organismo tal como E. coli como huésped para la clonación es que es un procariota, y por lo tanto carece de un núcleo unido a membrana (y otros orgánulos) encontrado en células eucariotas.

Las células huésped procariotas tienen ciertas limitaciones cuando la clonación y expresión de genes de eucariotas es el objetivo del procedimiento.

Las células eucariotas se extienden de microbios, tales como levadura y algas, a las células de organismos multicelulares complejos, tales como nosotros mismos. Las células microbianas tienen muchas de las características de las bacterias con respecto a la facilidad de crecimiento y la disponibilidad de mutantes. Eucariotas superiores presentan un conjunto diferente de problemas a la ingeniero genético, muchas de las cuales requieren soluciones especializadas. A menudo, el

...