CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL

FUNDAMENTO TEÓRICO

La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una clase de cromatografía sólido-líquido que permite la separación de moléculas en función de su tamaño. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatográfico. El gel está constituido por partículas esféricas que tienen poros de un determinado tamaño. Las moléculas de pequeño tamaño difunden a través de los poros de las partículas del gel y por ello son retardadas en su paso por la columna. Las moléculas grandes no entran en los poros de las partículas del gel y por ello eluyen rapidamente en lo que se denomina “volumen vacio” de la columna, se dicen que son excluidos del gel. De esta forma, las moléculas se separan en función de su tamaño, eluyendo en orden decreciente de peso molecular.

Se definen los siguientes parámetros:

• Intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel como los valores extremos (máximo y mínimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar.
• Volumen de elución es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna.
• Volumen de exclusión de la columna al volumen al que eluyen las moléculas de tamaño superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos entre las partículas de gel.

MATERIALES

Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al azar.

Los geles utilizados como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan hasta formar una red tridimensional. Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida.

En esta práctica se utilizará el gel dextrano. El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeñas bolitas) se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, según el tamaño de poro, proporcionando límites de exclusión comprendidos entre 1 y 200 000 daltons. Estos geles se identifican por una denominación de G-10 hasta G-200, lo que se refiere a la capacidad de retención de agua del Partícula de gel Molécula de la muestra.

MECANISMO

Las moléculas de tamaño mayor que el diámetro de poro en el gel no pueden difundirse al interior del gel por lo que están confinadas a la solución que rodea a las partículas de gel.

Las moléculas cuyo rango de tamaño se encuentran entre las muy grandes (excluidas de gel) y las muy pequeñas, pueden penetrar los poros en diferente grado, de acuerdo a su tamaño.

El acceso a los poros del gel está limitado por efectos estéricos. Si una molécula es más pequeña que el más pequeño de los poros del gel, dicha molécula será capaz de penetrar el volumen de poro total.

Las moléculas más grandes no pueden penetrar los poros, por lo que no son retrasadas y salen rápidamente de la columna.

CONCLUSION

Además de utilizarse para la separación de sustancias de distintos pesos moleculares o para la purificación de proteínas, se emplea para la determinación de pesos moleculares de proteínas. Para una gran variedad de tipos de geles se ha comprobado que existe una relación lineal entre el volumen de elución y el logaritmo del peso molecular de las proteínas. Por lo tanto, es suficiente medir el volumen de elución de una proteína desconocida para llevarlo a una recta de calibrado (preparada con proteínas puras de peso molecular conocido) y deducir aproximadamente su peso molecular.

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