Celulas Gigantes En Arroz

Análisis transcripcional a través de la secuenciación de ARN de células gigantes inducidas por Meloidogyne graminicola en las raíces del arroz.

RESUMEN

Una de las razones de la disminución del rendimiento progresivo observado en la producción de arroz aeróbico es la rápida acumulación de poblaciones del nematodo de la raíz de arroz Meloidogyne graminicola. Estos nematodos inducen células especializadas de alimentación dentro del tejido de la raíz, llamadas células gigantes. Mediante la inyección de efectores y bebiendo metabolitos de estas células, reprograman el desarrollo normal de las células y en la privación de la planta de sus nutrientes. En este trabajo se ha estudiado el transcriptoma de células gigantes en el arroz, tras el aislamiento de estas células por microdisección de captura por láser. Los perfiles de expresión revelaron una inducción general del metabolismo primario dentro de las células gigantes. Aunque las raíces se protegieron de la luz inducción, que detecta una notable inducción de genes implicados en la biogénesis de cloroplasto y la síntesis de tetrapirrol.

La presencia de cloroplasto - como estructuras dentro de estas células cultivadas en la oscuridad se confirmó por microscopía confocal. Por otra parte, los genes implicados en el metabolismo secundario y, más específicamente, la mayoría de los genes relacionados con la defensa fueron fuertemente suprimidos en las células gigantes. Además, la inducción significativa de las transcripciones que participan en los procesos epigenéticos se detectó en el interior de estas células 7 días después de la infección.

INTRODUCCIÓN

Plantas biotróficas patogenas han desarrollado estrategias sofisticadas para manipular a su huésped. Ellos obtienen todos sus nutrientes de tejidos vegetales vivos haciendo contacto íntimo con su huésped evitando al mismo tiempo una respuesta de resistencia. El arroz es una de las plantas de cultivo más importantes en todo el mundo y un excelente sistema modelo para el estudio de plantas monocotiledóneas. Las estimaciones de las pérdidas anuales de rendimiento debidas a parásitos nematodos de las plantas en este rango de cultivo de 10 a 25% en todo el mundo (Puente et al., 2005). Uno de los más agronómicamente importantes nematodos que atacan el arroz es el grupo de nematodos de la raíz del arroz (RKN) Meloidogyne graminicola. El ataque a las raíces de las plantas es por sedentarios nematodos parásitos de las plantas, como los RKNs (Meloidogyne spp.) que conducen al desarrollo de alimentación especializada de las células en el tejido vascular. La segunda etapa juvenil del RKN perfora las células vasculares seleccionadas con su aguja e inyecta las secreciones faríngeas, lo que conduce finalmente a la reorganización de estas células en las típicas estructuras de alimentación llamadas células gigantes, de la que el nematodo se alimenta por el resto de su ciclo de vida sedentario (Gheysen y Mitchum,2011). Reprogramación fisiológica y morfológica de alimentación inicial de la célula conduce al aumento del tamaño nuclear, la proliferación de los orgánulos, activación metabólica, alteraciones del ciclo celular, y cambios en la pared celular (Gheysen y Mitchum, 2011). La hiperplasia y la hipertrofia de las células circundantes conduce a la formación de una agalla en la raíz, que se forma típicamente en las puntas de las raíces en el caso del arroz RKN M. graminicola. En comparación con otros RKNs, M. graminicola tiene un muy rápido ciclo de vida. En suelos bien drenados a 22-29 ° C, el ciclo de vida de M. graminicola se completa en 19 días. La inflamación de la punta de la raíz se observa ya en 1 día después de la infección (dai). En 3 dai, terminales agallas en forma de gancho son claramente visibles (Puente et al., 2005). Después de tres mudas de los nematodos son maduros, en torno a 10-12 dai. Mientras que la mayoría de los otros RKNs depositan masas de huevos en la superficie de la vesícula, las hembras de M. graminicola ponen sus huevos dentro de las agallas, y juveniles eclosionados pueden infectar el mismo o raíces adyacentes.

Hemos estudiado recientemente los patrones de reprogramación transcripcional en agallas inducidas por el RKN M. graminicola en el arroz mediante secuenciación profunda de ARN (Kyndt et al., 2012a). El informe refleja las diferencias de expresión génica de una combinación de cambios que se producen en las células gigantes y los tejidos circundantes a las agallas. Debido a la dificultad técnica de aislamiento de las células gigantes desde la mayoría de los tejidos de la raíz y de los análisis del transcriptoma de raíz tienen hasta ahora centrado en la totalidad del tejido-agalla, en Arabidopsis y tomate (por ejemplo, Bar-Or et al, 2005;. Jammes et al, 2005,.). Sin embargo, aunque técnicamente desafiante, el contenido de células gigantes pueden ser aislado usando microaspiración (Wang et al., 2003) o micro disección laser-captura (LCM; Fosu-Nyarko et al, 2009.; Barcala et al, 2010;. Portillo et al, 2009, 2013). La investigación de Barcala et al. (2010) y Portillo et al. (2013) demostraron el carácter distintivo molecular entre las células gigantes y el tejido circundante agallas.

El objetivo de nuestra investigación fue estudiar los cambios transcripcionales en las células gigantes formadas en las raíces del arroz tras la infección de RKN.

LCM se combinó con la secuenciación de ARNm (mRNASeq) para estudiar el transcriptoma de células gigantes en dos puntos de tiempo después de la infección. Hemos comparado los datos con los informes de células gigantes y completamos las agallas inducidas por RKN en arroz y otras especies de plantas. Algunos de los cambios reportados eran de forma independiente validado por la transcriptasa inversa cuantitativa- PCR (QRT-PCR) y microscopía confocal. Nuestro estudio pone de manifiesto que las vías metabólicas, la homeostasis hormonal, y los procesos epigenéticos se ven afectados durante el desarrollo de las células gigantes.

MATERIALES Y MÉTODOS

Infección y LCM de células gigantes

Oryza sativa cv. 'Nipponbare' (GSOR-100, USDA) se germinó durante 6 días a 30 ° C, transferido al sustrato SAP (polímero de arena absorbente; Reversat et al, 1999) y se cultivaron además a 26 ° C bajo una 16 h / 8 h régimen de luz / oscuridad. Un cuidado especial se toma para evitar cualquier influencia de la luz sobre las raíces de las plantas. Los nematodos se cultivaron y extrajeron como se describe anteriormente (Kyndt et al., 2012b). A los 12 días de edad se inocularon las plantas de SAP con 250 etapas y 2 juveniles de M. graminicola por planta. Las plantas de control fueron inoculadas en maqueta con agua. Un día después de la inoculación de la las plantas se transfirieron a un sistema de cultivo hidropónico con solución de Hoagland (Reversat et al., 1999) para sincronizar el proceso de la infección. Ya infectadas y en el control de raíces se recolectaron a los 7 y 14 días y ubicadas en el fijador de Farmer (3:1 etanol / ácido acético). El material se deshidrató en etanol y luego con cryosectioned con un criostato a -20 ° C. RKN forma células gigantes en el tejido vascular, pero el tipo de células dirigidas específicamente es desconocido y puede incluso diferir entre los nematodos individuales en el mismo tejido de la planta (Endo, 1987). Por lo tanto, una mezcla de diferentes tipos de células del tejido vascular de las raíces del arroz maduro se utilizó como material de control en este estudio. Células gigantes y células de control fueron capturadas utilizando un Zeiss PALMA Laser Microbeam acuerdo con las instrucciones del fabricante (Zeiss, Jena, Alemania;. Fig. 1). Las células capturadas fueron infiltradas en tampón de lisis de extracción de ARN (Agilent, Waldbronn, Alemania). Tres repeticiones biológicas independientes fueron tomadas en cada punto de tiempo, de los cuales dos se analizaron por ARNm-Seq. La tercera repetición biológica independiente se utilizó para la validación de qRT-PCR. Alrededor de 150-200 secciones de células gigantes y 300 secciones de control (de las plantas no infectadas) por repetición biológica se utilizaron para las células gigantes y aislamiento de células de control por LCM.

La extracción de RNA, la preparación de los documentos y secuenciación de Illumina GAIIx

El ARN desde LCM-aislado de células gigantes se extrajo absolutamente con el ARN Nanoprep Kit (Agilent), seguido de la síntesis de ADNc utilizando la RNA-Seq sistema Ovation (NuGEN, Leek, Los Países Bajos). Este sistema se basa en la tecnología de Ribo-SPIA ® (NuGEN) para generar alta calidad, linealmente amplificada de ADNc a partir de bajas cantidades de ARN, y fue diseñado específicamente para plataformas de secuenciación de próxima generación. Las concentraciones obtenidas de ADNc variaron entre 4,8 y 6,6 g por muestra. La integridad de cDNAse se confirmó mediante el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent) y QRT-PCR con dos genes de referencia (complementaria Tabla S1).

La longitud completa de ADNc se fragmentó por sonicación con un Covaris ultrasonicador S2 (Covaris, Woburn, MA, EE.UU.). Los documentos de ARNm-Seq fueron construidos de acuerdo con los protocolos NEB E6040 (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.). Se utilizó los adaptadores de secuenciación de multiplexación previstas en la Multiplexación Muestra kit Oligo preparación (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.). Tamaño selección de la biblioteca se realizó en un gel de agarosa al 2% (baja Gama Ultra agarosa, Bio-Rad 161-3107, Bio-Rad, Nazareth Eke, Bélgica). El documento desnaturalizado se diluyó a una concentración final de 6 pM y se cargaron en una celda de flujo de lectura de dos a dos final (kit v5 TruSeq, Illumina). Para minimizar los efectos de rastro se multiplexaron las muestras.

Cada muestra fue secuenciada por duplicado en dos vías diferentes (cuatro vías en total con ocho marcas identificadoras múltiplex por vía). Después de clúster generación, el documento multiplexado se secuenció en un Illumina Genoma Analizador IIx (36 ciclos, de dos a dos finales).

Mapeando los datos del genoma y las transcripciones anotadas

Las lecturas fueron asignadas a la O. sativa subsp. Referencia japónica genoma (build MSU7.0) en dos fases utilizando la versión 1.3.1 TopHat Gemelos versión 1.0.3 (Trapnell et al., (Trapnell et al., 2009) y 2010). Una descripción detallada del flujo de trabajo y las configuraciones utilizadas en el análisis de los datos se da en Kyndt et al. (2012a).

Identificación de nuevas regiones transcripcionalmente activas

The Cufflinks (programa) genera un GTF incluyendo todas las transcripciones anotadas en MSU7.0 y nuevas transcripciones putativas derivados desde los datos. Todos los nuevos putativas regiones transcripcionalmente activas (nTARs) fueron marcadas como variantes de corte y empalme de genes que se sabe o se encuentra dentro de regiones intrónicas y se tuvieron en cuenta para los 18291 restantes nTARs BLASTx búsquedas y se realizaron en contra de Swiss-Prot y trEMBL y todas las proteínas de arroz predichas (http://rice.plantbiology.msu.edu/).

Homólogos de las nTARs en arroz etiqueta de secuencia expresada (EST) Se realizaron búsquedas en tBLASTx (E <0,0001).

Figura 1. Las secciones transversales de las células gigantes formadas por la RKN M. graminicola en raíces de arroz (O. sativa cv. 'Nipponbare'). (A) Control del tejido vascular; (B) las células gigantes en 7 dai antes. Las barras de escala en A y B: 25 micras. (C) las células gigantes en 7 dai antes del LCM, (D) las células gigantes en 7 dai después del LCM. Las barras de escala en C y D: 50 m. Esta figura está disponible en color a JXB en línea.

Cálculo, la normalización, y el perfil de la expresión génica

La expresión se cuantificó por muestra y por anotado o no anotado de transcripción como la suma de todas las lecturas que se asigna a los respectivos exones genéticos con una tolerancia de 16 pares de bases a cada lado para compensar los posibles errores en la anotación de genes. La expresión de los perfiles se evaluaron utilizando el R-package baySeq, versión 1.5.1. (Hardcastle y Kelly, 2010). Para compensar la diferenciación artificial leídas en las distribuciones, los tamaños de los datos originales se multiplicaron por factores de normalización adicional calculados usando la mediana cortada del método de M-valores descrito en Robinson y Oshlack.

Con la configuración estándar, implementado en el paquete bordeadora (versión 2.0.3). Una transcripción fue considerada para ser expresada si al menos una secuencia leída fuese mapeada para si en una de las muestras. Para todos los análisis adicionales del nivel de expresión de cada transcripción para cada condición se estimó mientras el pliegue del cambio (FC) de mapeado lee en relación con los controles. La FC se calculó como sigue: se leyó normalizado según lo descrito anteriormente y promediada sobre las repeticiones biológicas.

Antes de calcular la base 2 de registro de la relación de estos promedios, el número de lecturas se aumentó en 1 en cada grupo (para evitar valores nulos).

Gen Ontológico y análisis de enriquecimiento

Se realizó un análisis de Ontología de Genes (GO) y el enriquecimiento de GO utilizando agriGO (Du et al., 2010). El Análisis Paramétrico del Enriquecimiento del Gen Establecido (PAGE) (Kim y Volsky, 2005), basado en los niveles de expresión génica diferencial (log2FC), fue ejecutado. Benjamini y Hochberg descubrieron el falso análisis de la tasa (FDR) se realizó mediante los parámetros por defecto para ajustar los valores de PAGE.

Además, se utilizó MapMan (Thimm et al., 2004) para visualizar la expresión de los genes en las vías metabólicas y el test de WSR (con la corrección de Benjamini y Hochberg) se utilizó para probar la significación estadística de la expresión diferencial de estas vías.

Validación de ARNm-Seq por QRT-PCR

Con base en la potencial importancia funcional, se seleccionaron 13 genes para la validación en una muestra biológica independiente de QRT-PCR. Número de Locus de estas transcripciones, primeras secuencias, y la reacción eficiente fueron presentadas en la Tabla S1. QRT-PCR fue realizado y analizado como se describe en Kyndt et al. (2012b) utilizando tres repeticiones técnicas.

Microscopía confocal

Las agallas se recogieron a las 7 dai y puestas en el fijador de Farmer’s (03:01 etanol / ácido acético) durante una noche. Estas fueron deshidratadas por una dilución en serie de 70, 90 y 100% etanol (1 h cada uno) y se almacenó a 4 ° C durante 7 días antes del análisis microscópico. Para preparar las muestras para los microscopía confocal, las agallas fijadas se cortaron en secciones finas utilizando una hoja de afeitar y montado en un portaobjetos en una gota de agua. Imágenes fueron adquiridas con una Nikon A1R microscopio confocal, montado sobre un cuerpo Nikon Ti y equipado con una x (NA = 0,6) PLAN 40 Fluor ELWD objetivo. La adquisición de imágenes se realizó en un agujero de alfiler ajustado a 1 unidad Airy y un tamaño de píxel de 0,6 × 0,6 m (zoom Factor 1) o 0,2 × 0,2 m (factor de zoom 3). Para capturar el espectro huella digital (lambda pila) de autofluorescencia pigmento cloroplasto, las muestras se iluminaron con un láser de argón 488 nm y la emisión se detectó en un detector espectral de 32 PMT, programar a resolución de 2,5 nm por detector dentro de un rango de 655,5 a 735,5 nm. Como referencia, las pilas de lambda también se adquirieron a partir de fresco y secciones de hoja fija con ajustes idénticos. Perfiles espectrales de (supuesta) cloroplastos se determinaron mediante la medición de la media intensidad por intervalo de longitud de onda (2.5 nm) a través de la lambda apilar rango. Por condiciones, la media de los perfiles individuales de un mínimo de cuatro cloroplasto igual tamaño (), por regiones fue calculado.

Resultados

En este estudio, un análisis de expresión génica comparativa era llevado a cabo para investigar la respuesta a la infección del arroz con una especie de nematodos sedentarios, M. graminicola. Este nematodo induce la formación de sitios de alimentación especializados llamadas células gigantes en el tejido de la raíz. Para un análisis en profundidad de la reprogramación de la transcripción inducida en estas células, que se aislaron por LCM a las 7 y 14 dai y ARNm-Seq se llevó a cabo en el ARN aislado. Células de la raíz del tejido vascular de las plantas no infectadas de la misma edad fueron utilizadas como material de control. Luz transmitida microscópica del análisis reveló que a los 7 dai los nematodos se encontraban en el juvenil 3 (J3) o J4 etapa, al 14 dai la mayor parte del M. graminícola había madurado y la mayoría de las hembras habían puesto huevos. Las células gigantes contenían un citoplasma denso, la forma era oval o globular, y la pared celular era gruesa (Fig. 1). Por replicación bilógica y en el punto de tiempo 150-200 secciones de células gigantes (Fig. 1) o 300 secciones de control (a partir de plantas no infectadas) se utilizaron para la LCM de las células gigantes y vasculares, respectivamente. Después del control de calidad, el cDNA se secuenció utilizando el Illumina protocolo de ARNm-Seq. En total de 139 254 416 lecturas fueron adquiridas a partir de las células infectadas y no infectadas en los dos puntos de tiempo. Los datos pueden ser visitadas a través del repositorio GEO: GSE43577. La Lecturas cortas fueron alineadas en contra de toda la referencia de la secuencia del genoma del arroz cv. 'Nipponbare' (MSU7.0) y el 79,2% de los fragmentos secuenciados, 36 pares de bases lee en cada extremo de los fragmentos, podría ser mapeado (Tabla 1). Este porcentaje del mapeo es considerablemente más alto que figura en nuestro anterior análisis de ARNm-Seq en agallas completas (Kyndt et al., 2012a), donde en promedio sólo el 49,20% de las lecturas fueron mapeadas. El mayor número de mapeado lee en el actual análisis puede ser explicado por el hecho de que lee en pares finales que fueron usadas aqui, y debido a la naturaleza de las muestras; células específicas aisladas de dentro del tejido de la raíz tienen un menor oportunidad de contaminantes. La longitud total de las lecturas mapeadas fue más de 10 mil millones de bases, lo que representa casi 27 veces la cobertura del genoma del arroz y la cobertura de aproximadamente 97 veces del transcriptoma anotado. La expresión de un total de 54 206 transcripciones diferentes de arroz se detectaron en el análisis de tejidos. La correlación entre las dos repeticiones biológicas secuenciadas a partir de cada tipo de célula y en cada punto de tiempo era comprobado por medio del coeficiente de correlación de Pearson del valor de la expresión de cada gen después de la normalización. El promedio Pearson R entre dos repeticiones biológica era 0.9959 (P<2.2e−16).

Comparativo de perfiles de expresión génica se realizó mediante Gene Set Enrichment, mapeando el camino, y el análisis estadístico de los niveles de expresión génica diferencial entre las células infectadas y no infectadas en los diferentes puntos de tiempo. Además, la búsqueda se realizó para detectar nTARs no anotados en el genoma del arroz montaje MSU7.0, y los modelos de empalme (splicing) alternativo en las células aisladas de arroz.

El Transcriptoma cambia en las células gigantes en 7 días

A los 7 días de alimentación de los nematodos desde las células gigantes en las agallas, los tejidos se encontraban en la etapa de J3/J4. Un total de 42 756 transcripciones diferentes se encontraron para ser expresada en las células recogidas en este punto de tiempo. Se comparó el nivel de expresión de todos los loci (lugares) de arroz entre 7 dai de las células gigantes y células vasculares no infectadas en la raíces de la misma edad. Gene Set Enrichment analiza los niveles de expresión relativa (log2FC) de todas las transcripciones entre las células infectadas frente a las no infectadas revelaron que los genes involucrados en las categorías GO ‘proceso de biosíntesis’ (mayormente la traducción), 'ciclo celular', 'generación de metabolitos precursores y la energía’ , y ‘organización del componente celular’ eran fuertemente aumentada en 7 dai, mientras que los genes implicados en el 'tropismo', 'señalización', 'la respuesta a los estímulos‘ y ‘proceso del metabolismo secundario’

Tabla 1. Descripción general de los datos mRNA-seq obtenidos a partir de células gigantes inducidas por la infección por nematodos en las células del arroz y el control de los tejidos de la raíz vascular, y el mapeo de estas secuencias en el genoma del arroz.

Tabla 1 (aquí…)

'fueron en generalmente disminuyendo. Los genes con una función molecular anotados como "actividad estructural de las moléculas" y "unión de ácido nucleico" fueron generalmente superior expresados en 7 días de las células gigantes que en las células de control (Fig. 2). El mecanismo del mapeo fue con MapMan que mostró una significativa modificación de, por ejemplo, la glucólisis, el metabolismo del almidón, el metabolismo de trehalosa, la biosíntesis de homoserina, síntesis tetrapirrol, mecanismo del fenilpropanoide, producción de flavonoides, la síntesis del precursor de la pared celular, y pectina esterasas. La Figura 3 muestra el patrón de expresión de transcripciones que participan en la biosíntesis de tetrapirrol, con una alta frecuencia de transcripciones inducida en las células gigantes en comparación con el material de control. Las plantas superiores contienen cuatro clases de tetrapirroles - a saber, la clorofila, hemo, sirohemo, y fitocromobilin - y todos ellos juegan un papel vital en diversos procesos biológicos, incluyendo la fotosíntesis, respiración, nitrito, y la reducción de sulfito, así como diversos procesos celulares que incluyen la expresión de genes, proteínas

Figura 2. Análisis paramétrico de Gene Set Enrichment (PAGE) de los datos del transcriptoma de células gigantes inducidas por RKN en arroz a 7 dai (arriba) y 14 dai (abajo). Se muestran las puntuaciones Z de todos los GO términos de nivel secundario. Bares en gris oscuro indican GO términos que se upregulated en el tejido infectado en comparación con el control correspondiente; barras de color gris claro indican GO términos que son regulados a la baja en el tejido infectado en comparación con el control correspondiente.

Figura 3. MapMan visualización de los perfiles de expresión de genes implicados en la biosíntesis de tetrapirrol en 7 dias de células gigantes. La visualización muestra los patrones de expresión diferenciales observados, sobre la base de los log2FCs de los niveles de ARNm, en células gigantes versus control las células. Los puntos muestran los diferentes genes parálogos que codifican la enzima que cataliza un paso determinado. Los puntos rojos indican que el gen está upregulated en el tejido infectado en comparación con el control sano correspondiente, mientras que el verde indica la regulación a la baja.

importantes y el ensamblaje de las proteínas esenciales (Tanaka y Tanaka, 2007). Ellas son en su mayoría sintetizados en los plástidos. La Figura 3 muestra que casi todos los genes implicados en la biosíntesis de sirohemo, hemo, fitocromobilin, y la clorofila a, pero no clorofila b, se expresan en los niveles más altos en las células gigantes que en las células de control.

A las 7 días se encontraron 7709 transcripciones que fueron significativamente expresadas diferencialmente (FDR <0,05), con 650 transcripciones disminuidas y 7059 aumentadas en las células gigantes (Tabla S2). Trece de ellas fueron elegidos para la validación independiente basadas en su función potencialmente interesante función, y su patrón de expresión en las células gigantes se evaluó en una muestra biológica independiente por QRTPCR.

La tendencia de la expresión se confirmó en todos los casos menos en uno (Tabla S3). Las diferencias en los valores log2FC como obtenido a partir de ARNm-Seq y QRT-PCR se deben en gran medida a variación biológica y / o a las diferencias en los algoritmos aplicados para la estimación de los niveles de expresión.

Los genes con disminución fuerte en las células gigantes en comparación con las células no infectadas incluyen transcripciones de codificación de giberelina 2-β-dioxigenasa, que participan en el catabolismo de giberelina; calcona sintasa, que participan en la producción de flavonoides, disulfuro de proteínas isomerasa, que cataliza modificaciones de la proteína después de la traducción través de la formación y rotura de enlaces disulfuro; y dos NBS-LRR proteínas de resistencia-enfermedad. Entre las más fuertes transcripciones aumentadas fueron los que codificaron 78 proteínas transportadoras; OsBAK1, el BRASSINOESTEROID INSENSITIVE 1- asociada al receptor quinasa 1; ABIL2, se sabe que están involucrados en la regulación de la actina y la organización de los microtúbulos ; 17 células reguladoras del ciclo de la ciclinas; 10 tubulinas; seis miembros de la familia auxina sensible OsIAA-gen; otros seis factores de respuesta a auxina, y una remorin C-terminal dominio que contienen proteínas.

Validación experimental de cloroplastos y la clorofila contenida en las células gigantes en 7 días

Muchos informes sobre las interacciones planta-nematodos han analizado plantas que crecen en placas de Petri en un ciclo día / noche (Sijmons et al., 1991). En general, se sabe que el nematodo desarrollado se alimenta en sitios que contienen cloroplastos bajo la influencia de luz (Orion y Wergin, 1982; Golinowski et al, 1996;. Sijmons et al., 1991). Orion y Wergin estudiaron esto con microscopio electrónico y revelado la diferenciación de los cloroplastos desde amiloplastos dentro de estas células gigantes expuestas a la luz en tomate. Sin embargo, en el estudio actual, las raíces fueron completamente protegidas de la luz para evitar cualquier inducción artificial de la clorofila y la formación de cloroplasto. Curiosamente, los resultados de los datos del transcriptoma (fig. 3) revelan una fuerte inducción de los genes relacionados con la fotosíntesis en las células gigantes cultivadas en la oscuridad, y por lo tanto, decidimos para confirmar la presencia de clorofila a dentro de las células gigantes utilizando microscopía confocal. Para este fin, pilas lambda fijas de las secciones de células gigantes fueron adquiridas utilizando resueltos espectralmente microscopía confocal y se compararon con imágenes de secciones de hojas fijas y frescas. Las imágenes confocales demostraron que las hojas frescas de arroz contienen una densa matriz de cloroplastos fuertemente autofluorescentes, aproximadamente 5 micras en tamaño y forma como disco aplanado (Fig. 4A, 4D). Después de la fijación, el patrón de fluorescencia en la hoja se había transformado en un patrón puntiforme más, con cloroplastos fluorescentes limita a ≈ 1 micras el tamaño de los focos. Este efecto puntiforme es debido a la plausiblemente fijación y (especialmente) el procedimiento de deshidratación (Fig. 4B, 4C). Sorprendentemente, se observaron focos fluorescentes similares dentro de las células gigantes, aunque en un grado menor (Fig. 4C, 4F) y algunos autofluorescencias también se observaron en las células vecinas de las células gigantes. Sin embargo, los focos fluorescentes y autofluorescentes no se observaron en el control de raíces sanas (datos no mostrados). Para determinar si estos focos en las células gigantes contienen clorofila a, comparamos su perfil espectral con la de los cloroplastos en fijo y las secciones de hojas frescas (Fig. 4G). Pedrós et al. (2008) informaron de que la clorofila a emite un espectro de fluorescencia que se caracteriza por un mayor pico a 683 nm, que domina el espectro autofluorescente de los cloroplastos en la región de color rojo oscuro. En efecto, en el interior de los cloroplastos del material de hoja fresca un pico fluorescente con una intensidad máxima a 683 nm fue obtenida tras la excitación a 488 nm. En los cloroplastos de las secciones de hoja fija este pico se desplazó ligeramente hacia 678 nm, posiblemente debido al efecto del enfriamiento. Muy similar, aunque ligeramente cambiado, el pico fue observado en los presuntos cloroplastos de las secciones de la célula gigante, lo que sugiere la presencia de clorofila a en estas estructuras. El ligero desplazamiento del pico y la desviación desde

Figura 4. La microscopía confocal y el perfil espectral del cloroplasto (similar) autofluorescencia. (A-F) Confocal imágenes fueron adquiridas de secciones de hojas frescas (A, D), hojas fijas (B, E), y células gigantes fijos (C, F) en dos factores diferentes de zoom - 1 × (A, B, C) y 3 × (D, E, F) - con ayuda de un detector espectral configurar para capturar clorofila a autofluorescencia (655,5 a 735,5 nm). Cuadrados blancos en A, B, y C, muestran la región que fue magnificado en D, E y F, respectivamente. Las líneas de puntos en C delinean los límites de las células gigantes. Tenga en cuenta la diferencia de forma entre los cloroplastos de las secciones frescas y hoja fija y la presencia de estructuras de cloroplasto-como en el de células gigantes sección. (G) perfiles espectrales promedio, medida como intensidad media por intervalo de longitud de onda en el rango de pila lambda por lo menos cuatro (presunta) regiones del cloroplasto.

las curvas de referencia en las longitudes de onda más largas pueden ser debido a la ausencia de otros pigmentos (por ejemplo, carotenoides, xantofilas, clorofila b) que contribuyen al perfil espectral.

El Transcriptome cambia en las células gigantes en 14 dias

El nivel de expresión de todos los loci de arroz se comparó entre los 14 días en las células gigantes y células vasculares de la raíz no infectadas en el mismo punto de tiempo. En total, se encontraron 41 179 transcripciones diferentes establecidas para ser expresadas en las células de arroz recogidas. Aunque todavía está en curso los 7 días, la expansión de células gigantes y los reordenamientos del citoesqueleto termina entre 10-14 días en el caso de la infección Meloidogyne incognita en Arabidopsis (de Almeida-Engler et al., 2004). Análisis de enriquecimiento de grupos de genes de los niveles de expresiones relativas (Log2FC) de todas las transcripciones en las células infectadas vs no infectadas revelaron que los genes involucrados en la 'fotosíntesis', 'proceso metabólico del ADN "," organización del componente celular ',' generación de precursores de metabolitos y energía ', y' ciclo celular ' estaban fuertemente aumentados en 14 dai, mientras que los genes implicados en "Proceso del metabolismo secundario ", "respuesta a estímulos", y “la muerte celular” eran generalmente disminuidos. La codificación de las transcripciones para las proteínas con actividad 'nucleasa' y 'hidrolasa' fueron generalmente disminuidas (fig. 2). Al comparar el enriquecimiento del conjunto de genes de 7 y 14 días de las células gigantes (Fig. 2), las tendencias similares fueron observadas, aunque los genes en las categorías GO ' procesos metabolicos ',' actividad estructural de la molécula ',' parte del orgánulo', 'Lumen de la membrana cerrada "y" complejo macromolecular' muestran menos fuerte inducción a 14 días que en 7 días. Camino al mapeo se mostró con MapMan, similar a los datos del día 7, una modificación significativa del metabolismo del almidón y de la sacarosa, metabolismo de la trehalosa, la síntesis tetrapirrol y el camino del fenilpropanoide. Adicionalmente, modificaciones significativas fueron detectados en reacciones de luz, la producción de flavonoides, y los caminos relacionadas con la pared celular en 14 días en las células gigantes.

2884 transcripciones fueron significativamente expresadas diferencialmente en FDR <0,05. 238 de ellos fueron disminuidos, mientras que 2646 fueron aumentados (Tabla S4). Entre los genes más disminuidos, las transcripciones de codificación fueron fundadas para la sintasa nicotianamina, que participa en la biosíntesis de fitosideroforo; un glucano endo-1 ,3-β-glucosidasa precursor; α- DOX2, que participan en la síntesis de oxilipinas; factor de transcripción WRKY71; cuatro péptidos tionina similares; sintasa flavonoles, y fenilalanina amonio liasa, ambos involucrados en el camino de la fenilpropanoide. Las transcripciones fuertemente aumentadas incluido el almidón sintasa; Cullin-1; AP2-como ethyleneresponsive factor de transcripción AINTEGUMENTA, el cual regula el crecimiento y el número de células durante la organogénesis; roothairless-1, y genes implicados en el control del ciclo celular, tales como los que codifican ciclina-T1-1, quinasa dependiente de ciclina A-1, y quinasa dependiente de ciclina C-2.

Comparación entre 7 y 14 días en las células gigantes y 7 días para las agallas.

Se encontró un total de 942 genes que se expresaron diferencialmente (FDR <0,05) entre el control y células gigantes, tanto en 7 y 14 días. Correlación entre los valores log2FC- (GC frente control respectivo) de esos 942 genes fue Pearson R = 0,85 (P <2.2e-16). Esto demuestra que expresa de forma diferente los genes en 7 y 14 días muestran un perfil transcripcional similar.

En los siguientes párrafos los perfiles de transcripción de algunas vías específicas se exploran en las células gigantes (7 y 14 da), en comparación con los datos del transcriptoma generado previamente del día 7 en las agallas sanas del material del arroz (Kyndt et al., 2012a).

Transcripciones que participan en el metabolismo del ácido salicílico de las fitohormonas, ácido jasmónico, etileno, ácido abscísico y ácido giberélico

Como ya se ha descrito por Barcala et al. (2010) y Portillo et al. (2013) para el tomate y Arabidopsis (genero de plantas), los patrones de expresión en las células gigantes de arroz eran muy diferente a partir perfil transcripcional de todas las agallas (Kyndt et al., 2012a). Table S5 muestra el log2FC de genes implicados en la biosíntesis de diferentes hormonas vegetales en 7 y 14 en las células gigantes y 7 días para el material de toda la agalla(datos tomados de Kyndt et al., 2012a), cada uno en comparación con su correspondiente control del tejido no infectado.

Los resultados muestran que las transcripciones que participan en el ácido salicílico (SA) a través de la ruta de biosíntesis de fenilpropanoides se suprimen en las células gigantes tanto en 7 y 14 días, por ejemplo, muchos paralogues que codifican fenilalanina amonio liasa mucho menos expresado en las células gigantes en comparación con células vasculares no infectados (Cuadro S5).

Algunos de estos genes se establecieron para ser más bien inducidos en todas las agallas de los 7 días. Muchas transcripciones que participan en la biosíntesis de jasmonato, por ejemplo en la codificación de lipoxigenasas, la sintasa de óxido aleno, y reductasas 12-oxophytodienoate, se suprimen en 7 y 14 días en las células gigantes frente a células vasculares no infectadas de la raíz.

Muchas de estas transcripciones son más bien induce en 7 días en todas las agallas (Tabla S3). El hecho de que la biosíntesis del ácido giberélico (GA) y la señalización a través de proteínas DELLA es generalmente inducida en el tejido de las agallas fue reportado por Kyndt et al. (2012a), y los datos que se muestran en el presente estudio revelan que muchas de estas enzimas también expresadas a un nivel superior dentro de las células gigantes en ambos puntos de tiempo. El hecho de que los genes involucrados en la degradación de GA también son inducidos potencialmente debido a un efecto de retroalimentación para controlar la homeostasis de GA interna. Una gran cantidad de transcripciones que participan en la producción del ácido abscísico son inducidas en 7 días en las agallas, mientras que muchos genes de biosíntesis de ácido abscísico son reprimidos en 7 días en las células gigantes. Las células gigantes en 14 días tanto las inducidas y los patrones de expresión reprimida se observan. Sin embargo, la transcripción que codifica 8-hidroxilasa, involucrada en la degradación de ácido abscísico, es muy fuertemente inducida en las agallas y el tejido GC tanto a los 7 y 14 días. En el ET ruta de biosíntesis sea fuerte inducción o fuertes Se observó una supresión de diferentes 1-aminociclopropano- 1-carboxílico (ACC)-sintasa y paralogues ACC-oxidasa, pero no hay una tendencia clara se ve, aunque un poco más transcripciones de codificación ACC-oxidasa se encontraron en 7 agallas dai.

Transcripcional cambios en los genes que participan en epigenética modificaciones

Diferentes procesos epigenéticos, que no son necesariamente independientes entre sí, se han descrito para afectar la expresión de genes (Berger, 2007). Muchas transcripciones que participan en (post)-transcripcional silenciamiento génico, al igual que los de codificación Dicer y proteínas Argonauta, se inducen en el 7 dai células gigantes y algunos también en su totalidad 7 Material biliar dai (Tabla 2), pero esta tendencia no persiste en la célula gigante 14 Dai. Histonemodifyingenzimas también son upregulated dramáticamente en el 7 células gigantes dai, mientras que muestran los perfiles de expresión variable en las células gigantes 14 dai (Tabla 2). En el tejido de la vesícula completa perfil transcripcional se diluye por las células vecinas, pero uno de estos genes (LOC_Os01g59620) es significativamente más expresado en comparación con las puntas de las raíces no infectadas.

Nuevas transcripciones y transcripciones empalmados alternativamente

Se detectaron un total de 18 nTARs 291 en las células aisladas (Tabla S6). Una búsqueda BLAST se hizo en contra todas las tecnologías ecológicamente racionales de O. sativa, y todas las proteínas predecirse a partir del Proyecto del genoma O. sativa. 7383 nTARs dieron un golpe significativo (E<0,0001) contra al menos una EST a partir de O. sativa. tBLASTx en contra de todas las proteínas de O. sativa como resultado de los golpes de 3587 de la nTARs, lo que indica el potencial paralogy una transcripción de arroz conocida (Tabla S6).

Para predecir una función potencial de estas nTARs, un SwissProt / Búsqueda Trembl se hizo, y aunque esto fue un éxito para 4719 transcripciones de muchos de ellos fueron anotados como "Presuntos proteína no caracterizada, O. sativa '. Sin embargo, entre los se detectaron los nTARS los siguientes ortólogos de arroz: una Inhibidor de proteinasa de tipo Bowman-Birk herida inducida WIP1 (Zea mays), una proteína similar al receptor 12 (Arabidopsis thaliana), resistencia a las enfermedades proteína RGA2 (Solanum bulbocastanum), proteína reguladora NPR3 (A. thaliana), y giberelina 20-oxidasa 1 (A. thaliana) (Cuadro S4). Entre los nTARs, 12 185 nTARs mostraron una significativa patrón de expresión diferencial en las células gigantes frente a la células vasculares no infectadas, con 2.214 nTARs significativamente regulados a la baja en las células gigantes, y 9971 de manera significativa upregulated (FDR <0,05). Entre los nTARs downregulated eran, por ejemplo, las transcripciones que muestran homología con isoflavona reductasa y carotenoides 9,10 (9 ', 10') la escisión de dioxigenasa.

Posibles nuevos ortólogos de callose sintasa 3 y poligalacturonasa son a la vez significativamente inducida en las células gigantes (Tabla S6). Además de los nTARs, 16 063

Se detectaron las transcripciones empalmados alternativamente (Suplementario Tabla S6), entre los cuales 8.374 tienen diferencial significativo patrones de expresión (2465 hasta 5909 y upregulated).

DISCUSIÓN

Durante el ataque de patógenos, una planta huésped modula su gen expresión para rechazar al invasor, mientras que el patógeno produce proteínas efectoras de manipular el molecular maquinaria de la planta con el objetivo de aumento de la susceptibilidad.

Caracterización de la expresión génica en las células que son específicamente dirigido por los patógenos proporciona información detallada sobre este compleja carrera armamentista molecular. A lo mejor de nuestro conocimiento, este informe representa la primera combinación exitosa de LCM con ARNm-Seq para los perfiles de expresión en el campo de la interacciones planta-nematodo. Recientemente, se ha informado de un análisis del transcriptoma mRNA-seq basado de agallas inducidas por M. graminicola del arroz (Kyndt et al., 2012a). Dentro de este biliar, células gigantes en desarrollo sufren divisiones nucleares repetidas sin citocinesis para formar grandes células multinucleadas. Como células gigantes comprenden sólo una pequeña fracción del material biliar el análisis de la expresión génica a nivel de tipo celular único

Tabla 2. Cambios transcripcionales en genes involucrados en los mecanismos epigenéticos que obtenerse a través de ARNm-Seq, el 7 y 14 células gigantes dai (versus control células de la raíz vasculares) y 7 agallas dai (frente a puntas de control de raíz.; datos extraídos de Kyndt et al, 2012a)

Tabla 2 (aquí)

fue requerido para un estudio más a fondo sobre estos altamente especializado células de alimentación de nematodos. En el gigante de estudio células a las 7 y 14 dai y las células de control correspondientes fueron aislaron por LCM, y se compararon sus transcriptomes usando ARNm-Seq. En total 278 mil millones de dos a dos final ARNm-Seq lecturas fueron generado, que conduce a niveles de expresión estimados de más de 50 000 loci arroz anotadas y novedosa, con una cobertura de aproximadamente 100 veces el transcriptoma anotado.

Estudios previos sobre el tejido biliar completa y microdissected células gigantes de Arabidopsis, tomate, soja y (Bar-Or et al, 2005;. Jammes et al, 2005;.. Barcala et al, 2010,. Ibrahim et al, 2011) aplicó el análisis de microarrays, y por lo tanto sólo transcripciones representados en las matrices podría ser detectado. El beneficio de ARNm-Seq radica en el hecho de que junto a anotado transcripciones esta técnica permite que el detección de nuevos cruces de empalme, novela transcripciones, paralogues, y transcripciones raras (Sultan et al, 2008; Wilhelm. et al, 2008;. Zhang et al, 2010).. En efecto, el análisis descubrió 18 nTARs putativo de 291 y 16 063 empalmados alternativamente transcripciones expresadas en la célula arroz LCM-aislado analizado tipos. Altos niveles similares de splicing alternativo en el arroz tienen ha informado por Lu et al. (2010), quien estima que ≈ 48% de genes de arroz muestran patrones de splicing alternativo. Entre los nTARs, 12 185 son expresados diferencialmente, con 2.214 nTARs significativamente downregulated en las células gigantes y 9971 significativamente upregulated (FDR <0,05). Estos representan transcripciones que sólo pueden ser expresadas a muy bajo niveles y / o en determinadas circunstancias, por lo que no detectado en estudios anteriores.

En los párrafos siguientes cambios transcripcionales observada en las células gigantes de arroz se están comparando con la expresión resultados de Arabidopsis y células gigantes de tomate (Barcala et al, 2010;. Portillo et al, 2013), las agallas completos de tomate.

Arabidopsis, y el arroz (Bar-Or et al, 2005;.. Barcala et al, 2010; Kyndt et al, 2012a;.. Portillo et al, 2013), y sobre el suelo los tejidos de las plantas de arroz infectadas por nematodos (Kyndt et al., 2012b). Nuestros resultados también se compararon con los datos obtenidos de las plantas infectadas con nematodos del quiste, otro tipo de sedentaria nematodos parásitos de las plantas que forman los sitios de alimentación llamada sincitios (Ithal et al, 2007a, 2007b;. Klink et al, 2007.; Szakasits et al., 2009).

Los cambios metabólicos en las células gigantes inducidas por RKN infección en el arroz

La alimentación de los sitios de nematodos endoparásitos sedentarios, como Meloidogyne spp. y los nematodos del quiste, son la única fuente de nutrientes para estos parásitos raíz largo de su vida (Jammes et al, 2005;.. Szakasits et al, 2009). Este alto la demanda de recursos se refleja en la regulación al alza de genes implicados en el metabolismo primario de la planta celular, con una prominente inducción de la producción de almidón, algo ya observado por Barcala et al. (2010) en Células gigantes de Arabidopsis. También, sincitios formado por los nematodos del quiste tienda de hidratos de carbono por la acumulación de almidón en el plastidios (Hofmann et al., 2008), probablemente como un hidrato de carbono tampón y almacenamiento a largo plazo para compensar los cambios de la absorción de soluto por el nematodo. En contraste con la inducción del metabolismo primario, el metabolismo secundario de las células gigantes está muy deteriorada, por ejemplo, muchos downregulated transcripciones que participan en enilpropanoides producción.

La cadena lateral de flavonoide de la vía fenilpropanoide

La primera etapa en la ruta de fenilpropanoides se cataliza por la fenilalanina amonio liasa. Sorprendentemente, todos fenilalanina homólogos amonio liasa fueron suprimidos en gigante

las células en ambos puntos de tiempo investigados. Sin embargo, cuando se mira el tejido de todo el descaro que muchos de ellos fueron reprimidos en 3 dai (Kyndt et al., 2012a), pero indujo a las 7 dai (Suplementario Cuadro S5). Después de la desaminación no oxidativa de L-fenilalanina de ácido trans-cinámico por fenilalanina amonio liasa, las ramas vía fenilpropanoides en parte diferente cadenas responsables de la biosíntesis de metabolitos, diferentes como precursores de la lignina, flavonoides, ácido hidroxicinámico ésteres, y ácido salicílico (Boudet, 2000).

La supresión activa de la ruta de los flavonoides es una importante función de la patogenicidad en muchas otras planta-patógeno interacciones (Ah, y Collmer, 2005). De acuerdo con este punto de vista, nos encontramos con tanto ARNm-Seq y QRT-PCR que chalcona sintasa, la enzima clave en la rama lateral flavonoide de la ruta de los fenilpropanoides, se suprimió de forma significativa en las células gigantes de arroz (Tabla S3). Sin embargo, Hutangura et al. (1999) demostraron que la sintasa de chalcona se induce alrededor de la invasión de nematodos a las 24 h después de Infección de Meloidogyne javanica en el trébol blanco (Trifolium repens) y que los flavonoides fueron detectables en los alrededores el sitio de alimentación dentro de las 48 h del inicio del proceso de infección.

Del mismo modo, en otras interacciones planta-nematodos, genes involucrados en la biosíntesis de flavonoides se han notificado a ser inducida, por ejemplo, sobre la infección por nematodos migratoria en el arroz (Kyndt et al., 2012a) y la infección por nematodos del quiste de la soja y Arabidopsis (Ithal et al, 2007a;.. Jones et al, 2007). Los datos de las líneas de mutantes afectados en la biosíntesis de flavonoides mostraron que eran ya sea igual o más susceptibles a Heterodera schachtii (Jones et al., 2007), el apoyo a la ver que los flavonoides son producidos por la planta como parte de la respuesta de defensa contra los nematodos. Estos metabolitos tienen de hecho ha demostrado que tiene un efecto negativo directo sobre muchos especies de nematodos (Wuyts et al., 2006). Por lo tanto, la supresión de locales de la biosíntesis de flavonoides en las células gigantes podría ser una estrategia importante para el RKN para superar la defensa del huésped respuestas.

La Trehalosa

Antes del estudio actual, una activación de la trehalosa se observó en el metabolismo agallas enteros inducidos por RKN del arroz (Kyndt et al., 2012a) y el tejido sistémico del nematodo del quiste- las plantas infectadas (Hofmann et al., 2010). Sorprendentemente, en estudios centrados en los sitios de alimentación de nematodos aislados varios genes que codifican trehalosa-6-fosfato sintasa, una enzima necesaria para formar trehalosa 6-fosfato, fueron más bien downregulated (células gigantes: este estudio; sincitios: Szakasits et al., 2009). La trehalosa 6-fosfato tiene múltiples funciones en las plantas, no sólo en el almacenamiento de carbohidratos y el metabolismo sino también como un protector de estrés y como señalización metabólica molécula implicada en muchas interacciones planta-patógeno (Fernández et al., 2010) y la modificación de la pared celular (Bae et al., 2005). Además, otras transcripciones que son conocidos para responder a los estímulos abióticos y bióticos, como (receptor- similares) proteínas quinasas y el estrés y la enfermedad resistancerelated proteínas, por lo general fuertemente reprimidos en gigante las células en comparación con correspondiente vascular no infectado células de la raíz.

Células gigantes oscuro crecido contienen cloroplasto-como orgánulos

Raíces de las plantas se desarrollan principalmente plástidos no fotosintéticos, tales como que contienen almidón amiloplastos, pero las raíces de varios especies de plantas tienen el potencial de convertirse en verde cuando expuesto a la luz (Flores et al., 1993). Tras la exposición de luz, amiloplastos dentro de las agallas RKN-inducidos en raíces de tomate se informó de diferenciarse en cloroplastos (Orion y Wergin, 1982), y fenómenos similares son generalmente vistos en sincitios formados en las plantas de nematodos infectados con luz influencia (Sijmons et al, 1991;.. Golinowski et al, 1996). También nuestro estudio anterior transcriptoma de agallas completos mostró evidencia de la actividad fotosintética en 7 dai, pero de nuevo éstos resultados podrían estar sesgados debido a que el tejido no tenía ha protegido de la luz indirecta (Kyndt et al., 2012a). Hasta ahora, este fenómeno no se había investigado en células gigantes cultivadas en la oscuridad. Por eso, para el aquí descrito experimentos, el material fue completamente protegidos de luz. Para nuestra sorpresa, una fuerte inducción de photosynthesisrelated transcripciones y transcripciones implicadas en la biogénesis de los cloroplastos se encuentran constantemente en las células gigantes. Los genes relacionados con la biosíntesis de tetrapirroles, que principalmente se produce en el interior de los cloroplastos, son inducidos en el gigante células (Fig. 3). Tanto los datos de transcriptoma y microscópicas análisis (Fig. 4) confirmó que las células gigantes 7 dai, incluso sin estimulación de la luz, mantener las estructuras del cloroplasto-como, que contienen metabolitos con una emisión de fluorescencia similares espectro de tejido de la hoja de arroz.

Agotamiento de azúcar debido a los nutrientes bebiendo por el nematodo de la alimentación podría ser el desencadenante que activa el gen fotosintética expresión (Oswald et al., 2001). Además, los hallazgos recientes sugieren que las fitohormonas y ambientales (estrés) señales regulan la expresión de genes que están relacionados con metabolismo tetrapirrol. Sobre la existencia de una relación causal entre esta perturbación de la homeostasis de las hormonas y la acumulación de clorofila en las células gigantes sigue siendo estudiar más a fondo.

La modulación de las vías de la planta de la hormona en las células gigantes

Las hormonas actúan como moléculas de señalización en plantas por mediación respuestas fisiológicas, la coordinación de este modo el crecimiento y la diferenciación de las células, así como la inmunidad innata.

Consistente con los hallazgos recientes que demuestran un general la inducción de la biosíntesis de GA en las agallas de tomate y arroz (Bar-Or et al, 2005;.. Kyndt et al, 2012a) y sincitios en la soja (Klink et al., 2007), las células gigantes se acumulan altos niveles de transcritos que codifican para enzimas implicadas en la producción de GA y la respuesta (tales como el catabolismo y

Proteínas DELLA) (Cuadro S5). Giberelinas importantes son estimuladores de la división celular y elongación (Richards et al., 2001). Estas observaciones sugieren que los giberelinas son actores importantes en el desarrollo, mantenimiento, y la maduración de células gigantes. GA juega un papel crítico en el control y la coordinación de la división celular, la expansión de células, y, curiosamente, también la biogénesis de cloroplasto influyendo en la familia de proteínas DELLA en tejido de la hoja de tanto dicotiledóneas y monocotiledóneas especies de plantas. (Jiang et al., 2012).

Transcripciones necesarias para la biosíntesis de jasmonato se suprimen en las células gigantes 7 y 14 dai, aunque esto no fue observada en los tejidos de todo el descaro (Nahar et al, 2011;.. Kyndt et al, 2012a). También Ithal et al. (2007b) detectaron una fuerte y consistente, pero muy local, la supresión de la ruta del ácido jasmónico en sincitios aislado después de la infección de nematodos del quiste de la soja.

Es importante tener en cuenta que la activación del ácido jasmónico vía por la aplicación de jasmonato de metilo externo es una manera eficaz de proteger la patata, el tomate, y el arroz de RKN infección (Cooper et al, 2005;. Nahar et al, 2011;. Vieira dos Santos et al., 2013).

Aunque la aplicación del SA sólo analógico BTH traducido en poco menos información biliar del arroz (Nahar et al., 2011), se ha demostrado recientemente que tienen una fuerte negativa efecto sobre el desarrollo de Meloidogyne chitwoodi en tomate y papa (Vieira dos Santos et al., 2013). SA se deriva de la ruta de fenilpropanoides, y en línea con un local general y la represión sistémica de esta vía en 3 dai en las agallas y tejidos sistémicos en arroz (Kyndt et al., 2012a, 2012b) y el gigante Las células se formaron en Arabidopsis (Barcala et al., 2010), transcripciones implicada en la ruta de fenilpropanoides también son fuertemente downregulated en las aisladas células gigantes 7 y 14 dai formado en las raíces del arroz. Etileno (ET) se sabe que juega un sinérgico papel con ácido jasmónico en la inmunidad innata de la planta (Pieterse et al., 2009). Nahar et al. (2011) mostraron que ET-insensible mutantes y la inhibición farmacológica de la biosíntesis de ET en el arroz conduce a significativamente mayor susceptibilidad para RKN, demostrando que la ET desempeña un papel en la defensa contra RKN en estas plantas. Además, Fudali et al. (2013) demostraron que Plantas de Arabidopsis ET superproductoras son menos atractivas para RKN. Sin embargo, ET ha sido sugerido para ser crítico para la formación de sincitios durante las infecciones de quistes de nematodos en Arabidopsis (Goverse et al., 2000). Su papel ambiguo en la planta defensa contra el desarrollo del sitio de alimentación podría explicar ¿por qué no se observó ninguna tendencia clara con respecto a la vía ET en las células gigantes dai aquí estudiados-7 y 14 (complementario Cuadro S5).

El papel de los procesos epigenéticos en la transcripción reprogramación de las células de la raíz

Diferentes procesos epigenéticos se han descrito para afectar el transcriptoma de células de plantas: (1) metilación de citosina influye en la expresión génica mediante la alteración de la transcripción y estructura de la cromatina, (2) las modificaciones de histonas tienen un impacto importante en la estructura de la cromatina y puede hacer el ADN más o menos accesible para la transcripción, (3) ARN pequeños, como miRNA y siRNAs, influyen gen expresión a través de la degradación específica de los ARNm (postranscripcional el silenciamiento de genes) o la inducción de la metilación a secuencias de ADN complementarias (gen transcripcional silenciar).

Estudios recientes han demostrado la importancia de los pequeños RNAs durante la formación del sitio de alimentación nematodo del quiste (sincitio). Se identificaron las secuencias de miRNAs conocidos, así como si RNAs por secuenciación de pequeñas bibliotecas de ARN aislado de la alimentación sitios inducidas por el nematodo del quiste de Heterodera schachtii en las raíces de Arabidopsis (Hewezi et al., 2008), y los datos sugieren un papel para pequeños RNAs que median procesos de gen-regulación durante la interacción planta-nematodo. Hewezi et al. (2012) informaron de una fuerte regulación a la baja de miR396 a principios células sincitiales en comparación con el tejido de la raíz, que rodea cuando los nematodos se encontraban en la etapa J2 o J3 temprana. En adelante puntos de tiempo, cuando los nematodos llegaron a la etapa J3/J4, una específica Se observó miR396 regulación positiva en los países desarrollados alimentar sitio. miR396 objetivos de un conjunto de factores de crecimiento-regulación genes (Hewezi et al., 2012).

En las células gigantes de tomate, Portillo et al. (2013) informaron de que genes implicados en los procesos epigenéticos son inducidas a partir de 3 Dai y que aumente a 7 dai. Histona acetilación / desacetilación y metilación son mecanismos importantes que regulan la expresión génica en plantas (Zhou et al., 2010), y puede ser en gran medida involucrados en respuestas a los estímulos ambientales (Chen y Tian, 2007; Servet et al, 2010).. El aquí-informó transcripcional cambios en 7 dai en los genes que codifican modificadoras de histonas y pequeños ARN de procesamiento de enzimas (Tabla 2) confirman el papel de los procesos epigenéticos de reprogramación de la transcripción de las células de la raíz para formar sitios de alimentación de nematodos. Que transcripcional cambios están destinados específicamente por estas enzimas, y cuál es su importancia funcional, queda por se ha dilucidado.

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