DIAGRAMA DE HOLDRIDGE

IINTRODUCCIÓN

Los aminoácidos son compuestos de bajo peso molecular y de alta polaridad, que poseen simultáneamente carácter ácido y básico. En la naturaleza, losaminoácidos se encuentran libres o formando parte de las proteínas (poliaminácidos), de las cuales podemos obtenerlos por hidrólisis.Un aminoácido, químicamente, es una molécula que contiene un grupocarboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2) libres. Por lo general, son insolubles en solventes orgánicos (como éter o benceno), pero solubles enagua, álcalis diluidos, o ácidos diluidos.

AMINO ACIDO CARBOXILICO

Los α- aminoácidos naturales de origen animal o vegetal, aminoácidos naturales de origen animal o vegetal, o los que seobtienen por hidrólisis enzimático o ácida de proteínas o péptidos, sonóptimamente activas (excepto la Glicina), y por su configuración pertenecen ala serie L. Las rotaciones específicas son constantes valiosas para su identificación.

I. OBJETIVO

Realizar reacciones cualitativas (de coloración) sobre grupos funcionales de proteínas y aminoácidos.

II. PRINCIPIOS TEÒRICOS

Las proteínas son polímeros de aminoácidos de origen animal, vegetal o microbiano, que contienen siempre los elementos C, H, O, N y S. Por hidrólisis liberan aminoácidos que varían en número, cantidad y posición en cada especie proteica.

Las proteínas poseen un P. M. elevado el cual conduce a soluciones acuosas coloidales, su poder rotatorio levógiro y el carácter anfolito en solución. Para su estudio es necesario descomponerlos en sus aminoácidos que los constituyen para lo cual se recurre a la hidrólisis ácida, alcalina y enzimática.

Los aminoácidos son compuestos nitrogenados de gran importancia que como parte de las proteínas están en continuo intercambio respecto a su síntesis y degradación. Son solubles en medio acuoso y poco solubles en solventes orgánicos, tienen puntos de fusión muy altos aprox. 200 ºC debido a ellos se requiere alta energía para romper los enlaces iónicos en la red cristalina. Casi todos los aminoácidos, alifáticos existen como zwiteriones.

NATURALEZA QUIMICA DE LAS PROTEINAS SIMPLES

La presencia de sustancias de naturaleza proteica en el material biológico y en medicamentos se puede identificar con la ayuda de reacciones cualitativas sobre los grupos componentes de la proteína y sus grupos funcionales. Todas las reacciones conocidas de revelación de proteínas y péptidos se pueden dividir en 3 tipos:

1. Reacción sobre el enlace peptídico, especifica de la cadena poli peptídica y no propia para otras sustancias biológicas. La reacción es específica para proteínas y péptidos.

2. Reacciones sobre grupos terminales alfa-amino o alfa-carboxilo. Esta reacción, la dan también los aminoácidos libres y algunos otros compuestos.

3. Reacciones sobre ciertos radicales laterales o grupos de aminoácidos, que están en poli péptidos. Estas reacciones son específicas también para los alfa-aminoácidos libres y otras sustancias que contienen el grupo funcional correspondiente en la molécula.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

3.1. Muestras:

Solución de proteína de huevo (la proteína de huevo de gallina se le separa de la yema, se disuelve en un volumen 20 veces mayor de agua destilada, filtrar a través de varias capas de gasa y conservar en la refrigeradora.

Proteína de un huevo fresco no diluida.

Soluciones al 1% de glicina, glicilglicina, alfa-alanina, beta-alanina.

Soluciones al 0.01% de fenilalanina, tirosina, triptófano, histidina, hidrocloruro de cisteína, metionina, prolina, ácido aspárticos y glutámico, alfa-alanina, beta-alanina, lisina, arginina.

3.2. Materiales:

Tubos de ensayo, goteros, pipetas de 1 y 5 ml, probetas de 10 ml, baño de agua, termómetro, pinzas para tubos de ensayo.

3.3. Reactivos:

Reactivo de Biuret (contiene NaOH y iones de Cu2+), ninhidrina, solución acusa al 0,5%, ácido nítrico concentrado, hidróxido de sodio al 10, 20 y 40%, reactivo Millon, ácido acético glacial, ácido sulfúrico concentrado y al 2.5%, acetato de plomo al 5%, nitropusiano de sodio al 5%, a-naftol (0.2%) en alcohol, hipobromito de sodio, ácido sulfanilico (1%) en ácido clorhídrico (5%), nitrito de potasio (0.5%), carbonato de sodio (10%), sulfato de cobre (0.04 M), izatina (0.03%), solución acusa recién preparada de dialdehidoo-ftalico (disolver 2 gr. Dedialhedidoo-ftalico en 300 ml de agua destilada y luego destilar la solución acuosa), CuSO4 1%, reactivo de Pauly, carbonato de sodio 15%, nitrito de sodio 5%.

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. REACCION XANTOPROTEICA SOBRE EL ANILLO AROMATICO DE AMINOACIDOS CICLICOS.

El método se basa en la capacidad de los aminoácidos y de residuos de aminoácidos de poli péptidos que contienen anillo aromático ara formar por interacción con ácido nítrico concentrado, compuestos dinitro-derivados de color amarillo. En medio alcalino, estos compuestos forman grupos cromoforos con estructuras quinoides que tienen coloración anaranjada.

La reacción xantoproteica es característica para la fenilalanina, tirosina y triptófano, que tiene anillo aromático (bencénico). Estos aminoácidos o las proteínas que los contienen, por calentamiento con ácido nítrico concentrado dan nitrocompuestos de color amarillo. La gelatina por ejemplo, no contiene aminoácidos aromáticos y no da reacción positiva.

La reacción XANTROPROTEICA es un método que se puede utilizar para determinar la cantidad de proteína soluble en una solución. El espectrofotómetro se puede entonces utilizar para medir la intensidad del color que se produjo. Este test específico es para reconocer enlaces peptídicos, por lo tanto requiere de la presencia de al menos en tetra péptido para que de positivo. Los reactivos utilizados son NaOH y SO4Cu.5H2O. Opera a través del ion Cu2+ el que en reacción alcalina interacciona con los iones de N-3 de los grupos amino formando un complejo color violeta. Cada átomo de Cu2+ reacciona con dos átomos de N y establece una resonancia de electrones con otros dos N formando un complejo color violeta y es así como podemos catabolizar una reacción anastrófica de la mayor enzima llamada octatriona.

Se obtuvo bajo forma cristalina, una sustancia extraída de las paratiroides de la vaca que tiene los siguientes caracteres: poli péptido compuesto de muchos aminoácidos, todavía no determinados, y probablemente unidos a una proteína; da las reacciones de las proteínas por investigación química (reacción xantroproteica); contiene trazas de fierro y azufre; su pH es de 4.8; insoluble en las grasas y en el éter, algo soluble en el alcohol y muy soluble en el agua acidulada; es destruida por los fermentos digestivos y por esta causa no se administra por la vía digestiva.

OH

CH2

H2N C COOH

H

Curso de la determinacion.

Colocar en un tubo de ensayo 10 gotas de solución de proteína de huevo, en otro, fenilalanina, en el tercer tubo, tirosina y el cuarto histidina.

A cada tubo añadir 5 gotas de ácido nítrico concentrado, observar el precipitado blanco y denso y calentarlos hasta ebullición por un minuto (usar lentes protectores). Observar la aparición de coloración amarilla.

El contenido de los tubos se enfría bajo chorro de agua, luego a cada uno, por gotas se le añade solución de hidróxido de solio 40% (5 gotas aprox.) y observar la aparición de color naranja (no agitar el tubo). Esta reacción es útil para reconocer los aminoácidos Tir, Fen y Try.

4.2. REACCION DE HOPKINS-COLE (ADAMKEIWICZ) SOBRE TRIPTOFANO

El método se basa en la capacidad del triptófano de reaccionar, en medio acido con el ácido glioxilico con la formación del compuesto de color rojo-violeta.

El triptófano en esta reacción se condensa con el formaldehido que se desprende del ácido glioxilico por acción del ácido sulfúrico. Por calentamiento, dos moléculas de triptófano interaccionan con el ácido glioxilico con la formación del compuesto coloreado.

Utilizar en la reacción el ácido acético glacial, el cual como impureza tiene ácido glioxilico. Como agente deshidratante, en la reacción se utiliza ácido sulfúrico concentrado.

Curso de determinación.

En un tubo de ensayo colocar 2 gotas de proteínas no diluida de huevo fresco, en otra solución de triptófano.

A cada tubo agregar 10 gotas de ácido acético glacial y caliente cuidadosamente ambos tubos hasta disolución del precipitado formado en el primer tubo, después de los cual se enfría el contenido de este tubo. Con mucho cuidado después de inclinar el tubo, agregar por la pared de este aprox. 1 ml de ácido sulfúrico concentrado, cuidando de que los líquidos no se mezclen. En el límite de las dos capas surge un anillo coloreado característico que difunde por toda la solución.

4.3. REACCION DE FOLY SOBRE AMINOACIDOS QUE CONTIENEN AZUFRE (CISTEINA, CISTINA)

El método está basado en la capacidad de las proteínas, en la composición de las cuales se encuentran aminoácidos que contienen azufre (cisteína, cistina), de formar por calentamiento en medio alcalino, sulfuro

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