Efecto citopático

EFECTO CITOPÁTICO[pic 1]

De una caja de Agar Sangre con H. pylori incubada por 48 horas, se raspan las bacterias con un asa bacteriológica previamente esterilizada por calor y se pasan a 1 ml de medio RPMI con SFB al 10% sin antibiótico.

Se realiza una dilución 1:100 (10 µl de medio con bacteria + 990 µl medio RPMI) Se lee su longitud de onda a 550.

Tabla de confluencia: indica aproximadamente el número de células en diferentes cajas según su diámetro.

Caja P30                        100% Confluencia                1,900,000 células

Placa 96 pozos                100% Confluencia                64,000 células por pozo

CONGELACIÓN DE BACTERIAS (H. pylori)[pic 2]

Medio de congelación (una vez preparado se mantiene todo el tiempo en hielo).

                                        Vf= 2 ml

Caldo Brucella al 60%                1110 µl

SFB al 10%                                200 µl

Glicerol al 30%                        689.6 µl

Al caldo Brucella previamente se le realiza prueba de esterilidad (1 ml de caldo Brucella en 3 ml de caldo LB) se incuba a 37°C por 48 horas.

• Se apaga la campana y se enciende el mechero.
• Se utilizan colonias de H. pylori crecidas en Agar Sangre por 48 horas a 37°C.
• Todas las colonias de la placa a congelar se pasan con ayuda de un asa bacteriológica previamente esterilizada por calor a un eppendorf con 1 ml de medio de congelación (sin llevarse agar).
• Se homogeniza y se divide en alícuotas de 100 µl.
• Se rotula con el nombre de la cepa y la fecha de congelación.
• Se guarda a -70°C.

[pic 3]

EXTRACCIÓN DE DNA DE H. pylori

1. Una Caja de gelosa sangre con H. pylori crecida por 48 horas se divide en 2. Se pasan las bacterias raspando suavemente la superficie con ayuda de un asa bacteriológica previamente esterilizada por calor a 2 tubos que contienen 1 ml de PBS.
2. Se centrifuga a 10,000 G por 1 minuto, descartar el sobrenadante por decantación suave.
3. Agregar 180 µl de buffer ACL (homogenizar suavemente el paquete de bacterias) y 20 µl de Proteinasa K a la muestra y mezclar en vortex. Incubar a 56°C por 1 hora.
4. Agregar 200 µl de buffer CL y mezclar en vortex.
5. Agregar 200 µl de etanol (96%-100) y mezclar otra vez.
6. Transferir la mezcla anterior (incluyendo algún precipitado) a la Columna EZ-10. Centrifugar a 9000G (12000 rpm) por 1 minuto. Descartar el sobrenadante.
7. Agregar 500 µl de la solución CW1 y centrifugar a 9000G por 1 minuto. Descartar el sobrenadante.
8. Agregar 500 µl de la solución CW2y centrifugar a 9000G por 1 minuto. Descartar el sobrenadante.
9. Colocar la columna en un tubo eppendorf y centrifugar por 2 minutos a 9000G, para secar la membrana desechar el sobrenadante y transferir la columna a un tubo limpio de 1.5 ml. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (destapado el tubo) hasta que el etanol este completamente evaporado.
10. Agregar 50 µl de buffer CE directamente a la parte central de la membrana. Incubar a temperatura ambiente por 2 minutos. Después centrifugar por 2 minutos a 9000G para eluir el DNA. Recuperado 1
11. Adicionar 20 µl más de buffer CE al centro de la membrana. Incubar 2 minutos a temperatura ambiente y volver a centrifugar 2 minutos más a 9000G para eluir el DNA. Recuperado 2
12. Realizar la cuantificación de DNA.

    Se usan puntas nuevas para adicionar los reactivos del Kit a la muestra.

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