Fijación Técnica Histológica

Fijación

Los fijadores son sustancias químicas, mezclas o métodos físicos que nos permiten preservar los tejidos y evitar su destrucción.

La fijación debe consolidar una disposición espacial existente entre moléculas vecinas por medio de enlaces que soporten la manipulación del tejido.

Existen método Físicos y Químicos:

1) Físicos: Puede ser Calor o Congelación.

a) Calor: El calor permite la fijación del tejido coagulando las proteínas y disolviendo los lípidos. Este método no preserva de buena forma el tejido (en condiciones in vivo), pero si lo podemos ocupar complementando la fijación química.

b) Congelación: Esta no es en sí una fijación, pero si evita la autolisis deteniendo los procesos celulares. La congelación debe ser rápida evitando la formación de cristales de hielo. Las formas más utilizadas para un enfriamiento rápido son el uso de nitrógeno líquido (isopentano -169°c), bloques metálicos enfriados por N líquido (-170°c), Hielo seco (CO2 -75°C) o Helio líquido (-268°C). Para estos procesos se necesitas cortes de tejido de 2 mm.

Crioprotectores: Son sustancias que reducen el daño producido por los cristales de hielo, estás sustancias están tamponadas. Los más comunes son:

-Propilen Glicol

-Sucrosa

-Glicerol

-Dimetilsulfooxido

Existen 2 forma de fijación por congelación  Criodesecación y Criosustitución.

i) Criodesecación: La criodesecación se basa en congelar el tejido a muy bajas temperaturas (aprox. -40 °c y luego hacer sublimar el hielo de la célula (en una cámara al vacío). Este método no insolubiliza proteínas y conserva las sustancias de bajo peso molecular. Luego de criodesecado el tejido se puede incluir en parafina (pero no se puede poner en baño de flotación). Para mejorar la fijación se pueden usar vapores de formalina.

ii) Criosustitución: Esta consiste en poner al tejido en una solución deshidratante de disolventes orgánicos como etanol o acetona pero a temperatura aprox. de -49° c. Estos compuestos a esta temperatura deshidratan pero no precipitan las proteínas. Luego si subimos gradualmente la temperatura a 4°c el tejido se fija. Posteriormente para la aclaración e impregnación se usa n-butanol (aclara, deshidrata y fija).

Los métodos de fijación física se ocupan solo si:

-La muestra lo requiere.

-Si es que los fijadores químicos dañan la estructura que nosotros queremos observar.

-Cuando necesitemos una fijación más rápida.

2) Químicos: Estos tipos de fijadores imprimen cambio en el tejido como:

-Aumento de tamaño

-Disminución de tamaño

-Endurecimiento

Estos fijadores se clasifican según los efectos que producen en las proteínas (forma de acción) en:

a) No precipitantes (aditivos): Interaccionan químicamente con grupos específicos de biomoléculas de las células (por lo general proteínas) insolubilizándolas (más interacción prot-prot y menos agua-prot). No deshidratan (porque no quitan la capa de solvatación de las proteínas). Forman una malla con características de un gel insoluble.

b) Precipitantes (no aditivos): Por lo general son disolventes orgánicos que no interaccionan químicamente con las proteínas, pero si quitan las moléculas de agua que componen la capa de solvatación de estas, esto disminuye la interacción agua-prot por lo cual las insolubiliza y además disminuye la interacción de puentes de hidrógenos entre a.a polares en las proteínas; esto conlleva a que las proteínas globulares pierdan esta estructura terciaria o cuaternaria y queden coaguladas (estructura secundaria). Al perder la capa de solvatación estás precipitan.

Los métodos químicos sirven para estabilizar proteínas simples y conjugadas, pero consigo trae cambios de aumento o disminución de tamaño al igual que la dureza del tejido.

a) Efecto precipitante: Como explicamos anteriormente se rompen los enlaces débiles de la proteína (puentes de hidrógeno) ocurriendo 2 cosas: 1- Pierden su capa de solvatación y 2- pierden su estructura terciaria, cuaternaria o secundaria y queden con una estructura primaria (desnaturalización) insolubilizándolas. Recordar que la forma globular de las proteínas en agua posee sus a.a polares hacia la superficie y los apolares en el interior, por lo cual cuando se desnaturalizan y quedan filamentos estos dejan toda su parte apolar expuestas (a.a apolares), perdiendo capa de solvatación e interacción con el agua, produciendo la precipitación.

b) Efecto reticulación proteica: Los grupos específicos de los fijadores interactúan con grupos específicos de las proteínas (por lo general grupo amino), estos forman enlaces y disminuyen la interacción agua-prot (puentes

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