Fraccionamiento Celular

Introducción:

El fraccionamiento celular es una técnica bioquímicautilizada para separar los distintos orgánulos ycomponentes celulares para su estudio. La técnica seinicia con la homogeneización. El tejido se tritura en unhomogeneizador de manera que las células secomprimen y se libera su contenido. Lo que luego sehace con ese extracto es someterlo a diferentescentrifugaciones a diferentes velocidades y tiempos, demanera que obtenemos fracciones enriquecidas de losdistintos orgánulos.Homogenización. Para preparar los tejidos para elfraccionamiento celular, primero se debe suspender enun medio apropiado (una solución amortiguadora,salina ó azúcar isotónica). Para mantener la integridadde los orgánulos y enzimas durante el procedimientode la fraccionación, todas las soluciones y cristaleríadeben mantenerse frías. Después de rebanar las hojas,el tejido está preparado para la homogenización,procedimiento que rompe los enlaces celulares y liberael contenido celular, sin dañar el medio en suspensión.La suspensión de células constituyentes se llamahomogenado. Para los tejidos de plantas, lahomogenización se debe realizar con un mortero alcual se le añade arena como abrasivo. En este proyectolos cloroplastos se aislarán de la espinaca; núcleos ymitocondria se aislarán de la coliflor.Centrifugación. Debido a las diferencias en tamaño ydensidad, cada componente celular está sujeto a unafuerza centrífuga. La fuerza generada por la centrífugase expresa como fuerza centrífuga relativa (RCF)en unidades de g. La RCF es una función de velocidadde centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) yla distancia de partículas desde el eje de rotación.Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puededeterminar el RCF de la ecuación: RCF =1.19 x 10-5(rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm)desde el eje de rotación hasta el margen de afuera deltubo de centrífuga.Centrifugación Diferencial. En la centrifugacióndiferencial, el homogenado es centrifugadorepetidas veces a altas velocidades, sedimentándoloprogresivamente en pequeñas partículas. El métodoestá ilustrado en la fig. 2. La primera centrifugación esa 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fracción nuclear. Este pellet´ contiene el núcleo, células intactasy tejido.. L próxima separaciones el sobrenadantepostnuclear ó partículas suspendidas en líquido sobreel ³pellet´ nuclear, el cual es transferido a otro tubo decentrífuga y se centrífuga a 10,000 g por 30 minutos enuna centrífuga refrigerada. El material sedimentado seconoce como fracción mitocondrial; éste contienemitocondria y micro cuerpo.

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