Fundamento de la práctica

Fundamento de la práctica

Una forma de medir la actividad de la catalasa, es colocarla en presencia del sustrato un tiempo determinado, luego detener la reacción por desnaturalización y finalmente cuantificar el sustrato residual. En la práctica a realizarse la acción de la enzima se detiene al agregar H2SO4 6N. La cuantificación del sustrato no transformado (residual) se medirá mediante titulación con permanganato de potasio de acuerdo a la siguiente reacción:

2 MnO4-- + 5 H2O2 + 6 H+ --------- 5O2 + 2 Mn+2 + 8 H2O

Materiales y reactivos

- Centrígufa - Tubos de ensayo

- Tubos heparinizados - Erlenmeyers

- Jeringas - Pipetas graduadas

- Algodón - KMnO4 0.002 M

- Baño 95º C - H2SO4 6N

- Pipetas plásticas - KCN 0.5 M

- Cronómetro - Buffer fosfato

- Soporte universal 50 mM pH 7.0

- Pinza para bureta 50 mM pH 6.0

- Baño hielo 50 mM pH 8.0

- Buretas - Peróxidos de Hidrógeno 0.09 M

- Solución de catalasa 0.2%

La práctica debe realizarse a 4 º C, debido al elevado número de recambio de esta enzima durante un período de 7 minutos.

Procedimiento

1. Extracto Enzimático: En un tubo heparinizado colocar 5 ml de sangre y luego centrifugar a 5000 r.p.m. durante 5 minutos. Eliminar el plasma y lavar las células con solución salina isotónica (NaCl 0.9% w/v). Las células se lisan adicionando 4 volúmenes de agua destilada (V/V). Para el ensayo, el stock de lisis se diluye 1: 500 con buffer fosfato salino ( pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0).

2. Medida de la actividad enzimática: NOTA: Es importante recordar, que el ensayo debe realizarse a 4°C mientras la enzima esté en presencia del sustrato.

2.1 Marcar 12 tubos de ensayo como B 1, 2, 3,.......,12.

2.2 Tomar en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de catalasa y calentarlo durante 10 minutos a 92ºC.

2.3 El tubo B es el Blanco por lo tanto no se agrega enzima.

2.4 Agregar en orden los reactivos, de acuerdo a la siguiente tabla:

Reactivo/Tubo B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Buffer pH 7 (ml 3 - - 3 3 3 5 4 3 2 1 0.5 3

Buffer pH 6 (ml - 3 - - -- - - - - - - - -

Buffer pH 8 (ml - - 3 - - - - - - - - - -

Sustrato H2O2 4 4 4 4 4 4 2 3 4 5 6 6.5 4

H2SO4 6N (ml) 1 - - - - 1 - - - - - - -

KCN gotas - - - - 5 -- - - - - - - -

Catalasa

Calentada (ml) - - - 1 - -- - - - - -- - -

Catalasa ** - 1 1 - 1 1 1 1 1 1 1 1 -

Extracto enzimático 1

** A los tubos 1 y 2 se debe agregar la enzima o catalasa con el buffer de pH respectivo.

- Los tubos No 1 y 2 muestran el efecto del pH

- El tubo No 3 muestra el efecto desnaturalizante por calor.

- El tubo No. 4 muestra el efecto de un inhibidor (KCN)

- El tubo No. 5 muestra el efecto de un agente químico desnaturalizante (H2SO4)

- Los tubos del No. 6 al 11 muestran el efecto de la concentración inicial del

sustrato a una concentración de enzima constante.

2.5 Pasados 7 minutos a 4C la reacción se detiene agregando 1 ml de H2SO4 6N a cada tubo y el contenido de cada uno se transfiere a un erlenmeyer marcado respectivamente y enjuagando cada tubo con agua destilada y llevando a un volumen final de 30 ml. Para la cuantificación del sustrato que no reaccionó (residual) se realiza una titulación con KMnO4 0.002M, el cual debe colocarse en una bureta a fin de agregarse en volúmenes de 0.5 ml hasta obtener una coloración violeta o punto final de la titulación.

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