Fundamento de la práctica
Enviado por ghio2911 • 15 de Octubre de 2013 • Informes • 516 Palabras (3 Páginas) • 438 Visitas
Fundamento de la práctica
Una forma de medir la actividad de la catalasa, es colocarla en presencia del sustrato un tiempo determinado, luego detener la reacción por desnaturalización y finalmente cuantificar el sustrato residual. En la práctica a realizarse la acción de la enzima se detiene al agregar H2SO4 6N. La cuantificación del sustrato no transformado (residual) se medirá mediante titulación con permanganato de potasio de acuerdo a la siguiente reacción:
2 MnO4-- + 5 H2O2 + 6 H+ --------- 5O2 + 2 Mn+2 + 8 H2O
Materiales y reactivos
- Centrígufa - Tubos de ensayo
- Tubos heparinizados - Erlenmeyers
- Jeringas - Pipetas graduadas
- Algodón - KMnO4 0.002 M
- Baño 95º C - H2SO4 6N
- Pipetas plásticas - KCN 0.5 M
- Cronómetro - Buffer fosfato
- Soporte universal 50 mM pH 7.0
- Pinza para bureta 50 mM pH 6.0
- Baño hielo 50 mM pH 8.0
- Buretas - Peróxidos de Hidrógeno 0.09 M
- Solución de catalasa 0.2%
La práctica debe realizarse a 4 º C, debido al elevado número de recambio de esta enzima durante un período de 7 minutos.
Procedimiento
1. Extracto Enzimático: En un tubo heparinizado colocar 5 ml de sangre y luego centrifugar a 5000 r.p.m. durante 5 minutos. Eliminar el plasma y lavar las células con solución salina isotónica (NaCl 0.9% w/v). Las células se lisan adicionando 4 volúmenes de agua destilada (V/V). Para el ensayo, el stock de lisis se diluye 1: 500 con buffer fosfato salino ( pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0).
2. Medida de la actividad enzimática: NOTA: Es importante recordar, que el ensayo debe realizarse a 4°C mientras la enzima esté en presencia del sustrato.
2.1 Marcar 12 tubos de ensayo como B 1, 2, 3,.......,12.
2.2 Tomar en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de catalasa y calentarlo durante 10 minutos a 92ºC.
2.3 El tubo B es el Blanco por lo tanto no se agrega enzima.
2.4 Agregar en orden los reactivos, de acuerdo a la siguiente tabla:
Reactivo/Tubo B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Buffer pH 7 (ml 3 - - 3 3 3 5 4 3 2 1 0.5 3
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