PRÁCTICA N° 5. EXTRACCIÓN DE ADN V E G E TA L

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PRÁCTICA N° 5.

EXTRACCIÓN DE A DN V E G E TA L

1. OBJETIVOS

Obtener ADN de diferentes tejidos vegetales empleando el método de extracción basado en CTAB.

1. INTRODUCCIÓN

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre si formando una doble hélice.

Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina).

Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa, esto se aprovecha para su extracción. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite. Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas positivamente.

A lo largo del tiempo se han diseñado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad y calidad de ADN adecuados, así como garantizar la eliminación de inhibidores

potenciales que dificulten el tratamiento posterior de la molécula. Los métodos tradicionales, desarrollados en los años 50, utilizan solventes orgánicos para separar a las proteínas del ADN y, una vez suspendido en la fase acuosa, aislarlo por precipitación con etanol. Estos métodos requieren preparar soluciones y la extracción puede tomar desde unas horas hasta varios días por los numerosos pasos que deben realizarse. En general, los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales: homogeneización del tejido, lisis celular, separación de proteínas y lípidos, precipitación y redisolución del ADN.

Existen combos o kits de extracción que utilizan matrices inorgánicas compactas cargadas positivamente capaces de retener varios microgramos de ADN y separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un extracto libre de inhibidores. Los combos se venden en presentación de membranas de sílice o perlas magnéticas, las primeras están formadas por una resina y las segundas consisten de un centro de hierro recubierto por resina. La membrana esta insertada dentro de un microtubo de polipropileno y las microesferas se encuentran suspendidas en una solución amortiguadora.

Durante la extracción, el ADN cargado negativamente se adsorbe o une a la matriz selectiva de manera reversible y se mantiene unido a esta durante la remoción de lípidos, proteínas y metabolitos secundarios, posteriormente la molécula se libera de la matriz.

Los combos también incluyen soluciones de lisis, unión y lavado que no contienen fenol ni cloroformo para extraer proteínas, tampoco requieren etanol para precipitar al ADN. Los kits comerciales disminuyen la extracción a unas cuantas horas porque reducen el número de pasos del procedimiento y, utilizados bajo las recomendaciones de cada proveedor, garantizan una extracción de alta pureza ya que tanto la recuperación del ADN como la eliminación de contaminantes son muy eficientes.

La selección del método de extracción es un paso fundamental en las técnicas moleculares y depende del organismo bajo estudio, el tejido disponible y su estado de conservación, la técnica que se aplicara posteriormente, así como la infraestructura de los laboratorios, los recursos económicos y tiempo

para obtener resultados. Independientemente del método seleccionado es recomendable encontrar un equilibrio entre pureza y rendimiento de acuerdo a la aplicación posterior.

2.1. Electroforesis

La electroforesis es una técnica que emplea diferencias en carga eléctrica para separar moléculas de una muestra. Las moléculas de DNA tienen carga negativa, y cuando se someten a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo. La tasa de migración de una molécula depende de su forma y de su relación masa/carga. La electroforesis en geles preparados con agarosa, poliacrilamida o una mezcla de ambos, genera una red compleja de poros a través de los cuales las moléculas de ADN deben viajar en su tránsito al polo positivo, separando las moléculas por tamaño. Las moléculas de ADN más pequeñas migran más rápido a través del gel.

En la práctica, la composición del gel determina el tamaño de moléculas que se pueden separar. Por ejemplo, geles de agarosa al 0.5% permiten separar moléculas muy grandes ya que tiene poros grandes, se emplean para moléculas de 1 a 30 kb, lo que permite ver diferencias entre moléculas que pesan de 10 a 12 kb. El gel estándar se prepara al 0.8% y geles más concentrados, como por ejemplo al 1.5 o 2% permiten distinguir diferencias de tamaño entre 50 y 100 pb. Los geles de poliacrilamida al40% tienen poros muy pequeños y permiten separar moléculas de ADN muy pequeñas, de 1 a 300 pb, por lo que es posible distinguir entre moléculas  de ADN que difieren en tan sool  un nucleótido.

La forma más sencilla de visualizar un gel de electroforesis de agarosa, es mediante la tinción con bromuro de etidio, un agente intercalante de ADN, bajo la irradiación de luz ultravioleta.

La limitante es que una concentración de ADN menor a 10 ng no es posible detectarla.

La determinación del peso molecular, se hace mediante un marcador de peso molecular, el cual está compuesto por múltiples fragmentos de DNA de tamaño conocido que en general nos indican un rango de tamaños que son múltiplos de 100 pb o bien de 1000 pb.

1. MATERIALES Y EQUIPO.

1. Materiales.

• Tubos tipo eppendorf de 1.5 mL
• Micropipetas de 100 y 1000 µL
• Puntas para micropipeta de 100 y 1000 µL
• Mortero y pistilo
• Nitrógeno líquido
• Recipiente con hielo
• Minicentrífuga
• Agitador tipo vórtex
• Incubadora de bloque seco (termo bloque)
• Espectrofotómetro ultravioleta/visible (NanoDrop).
• Cámara de Electroforesis de DNA y fuente de poder
• Micropipeta de 10 µL
• Puntas para micropipeta de 10 µL
• Charola y peine para geles
• Sistema fotodocumentador de geles
• Recipiente con hielo

1. Soluciones, Reactivos y Material Biológico.

• Material Vegetal (hojas o raíces de plántulas de Arabidopsis, maíz, alfalfa, tabaco).
• Buffer CTAB 2X [CTAB 2% (W/V), NaCl 1.4 M, Tris-HCl 100 mM (pH 8.0), EDTA 20 mM]
• Cloroformo
• Isopropanol (previamente enfriado a -20°C)
• Etanol al 70% (previamente enfriado a -20°C)
• Agua destilada estéril
• Agarosa
• Buffer de corrida (TAE 1X: Tris acetato 40 mM, EDTA 1 mM)
• Buffer de carga naranja G 6X
• Marcador de peso molecular de 1 kb
• Muestra de DNA plasmídico obtenido en la práctica 1
• Bromuro de etidio (Solución stock 10 mg/mL)

1. Uso obligatorio

• Guantes
• Bata blanca de algodón

1. PROCEDIMIENTO.

1. Procedimiento: observar los siguientes enlaces.

• Extracción de DNA | | UPV https://www.youtube.com/watch?v=nXeB1Ib13P8

• Extracción de ADN vegetal. https://www.youtube.com/watch?v=KPgSfu3nig8

• Extracción y purificación de ADN https://www.youtube.com/watch?v=a8d8ZNSX880

• Electroforesis en gel de agarosa | | UPV https://www.youtube.com/watch?v=U1g2qt3juZw

• Electroforesis en gel tutorial paso a paso https://www.youtube.com/watch?v=W_nc1DOqDrI

1. Protocolo de Extracción de DNA vegetal

• Macerar finamente el material vegetal en un mortero con nitrógeno líquido.
• Colocar 100 mg de material vegetal molido en un tubo tipo eppendorf y agregar 200 µL del Buffer de extracción CTAB 2X. Mezclar en agitador tipo vórtex.
• Colocar la muestra en una incubadora de bloque seco (termo bloque) a 65°C por 15 min; después deje enfriar la muestra a temperatura ambiente sobre la mesa de trabajo.
• Adicionar 200 µL de cloroformo. Mezclar en agitador tipo vórtex. Centrifugar la muestra por 5 min a una velocidad de 12, 000 x g.
• Transferir la fase acuosa a un tubo tipo eppendorf limpio por pipeteo.
• Adicionar 200 µL de isopropanol frío y colocar el tubo 15 min en hielo.
• Centrifugar por 5 min a una velocidad de 12,000 x g. Una vez centrifugado, descartar el sobrenadante por decantación.
• Adicionar 700 µL etanol al 70% para lavar la pastilla obtenida.
• Centrifugar por 2 min a una velocidad de 12, 000 x g. Una vez centrifugado, descartar el sobrenadante por decantación y secar la pastilla a temperatura ambiente.
• Resuspender la pastilla en 25-30 µL de agua destilada estéril.
• Determine la cantidad de DNA obtenido por cuantificación en un espectrofotómetro ultravioleta/visible (NanoDrop).
• Separar mediante electroforesis en gel agarosa las moléculas de DNA genómico obtenidas.
• Almacenar el DNA a -20°C. Todo el material que se almacena debe estar

correctamente rotulado con su nombre y fecha.

1. Procedimiento para electroforesis de DNA

Lea cuidadosamente el procedimiento a desarrollar.

Preparación del gel de agarosa al 0.8%: pesar 0.4 g de agarosa y disolver en 50 mL de buffer TAE1X. Fundir lentamente en el microondas hasta que la agarosa este líquid a. Esperar a que enfríe un poco para agregarle 1 µL de la solución stock de bromuro de etidio, agitar para disolver bien. Enseguida verter en la charola y ajustar bien los peines. Esperar a que solidifique a temperatura ambiente por lo menos 15 minutos, para su posterior uso.

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