Preparacion De Celulas Competentes

El proceso de transformación se puede describir como la alteración genética de una célula, resultante de la absorción directa, incorporación y expresión del material genético exógeno incorporado de su entorno, a través de la membrana celular. A continuación se presenta la metodología a seguir para obtener células bacterianas de las cepa TOP10 de Escherichia coli quimiocompetentes y electrocompetentes para la introducción de ADN plasmídico de concentración conocida (15 ng/µl). Después de sembrar las células competentes en placas LB con ampicilina, se calculó la eficiencia de transformación para cada caso. Se obtuvo una mayor eficiencia de transformación en las células quimiocompetentes que en las electrocompetentes. Se analizaron posibles fallas durante el procedimiento que pudieron afectar la transformación con células electrocompetentes entre ellas, errores al realizar la dilución. La metodología requirió de trabajo previo (2 días), dos sesiones en el laboratorio y una visita al laboratorio para el conteo de colonias y el cálculo de la eficiencia de transformación.

INTRODUCCIÓN

La transformación es el proceso por el cual un organismo adquiere ADN exógeno. El proceso puede ocurrir de dos maneras; de forma natural que se describe por la absorción e incorporación del material genético, del medio ambiente natural de la célula, o bien, de forma artificial, que abarca diferentes métodos que permiten inducir la capacidad de incorporar el ADN exógeno . De esta forma, además de la conjugación y la transducción, la transformación es uno de los 3 procesos principales por los que el material genético exógeno se puede introducir en una célula bacteriana.

La transformación fue descubierta en Streptococcus pneumoniae en 1928 por Frederick Griffith, y en 1944, Oswald T . Avery, Colin M. MacLeod y McCarty Maclyn demostraron que el "principio de la transformación" era el ADN. Ambos resultados son hitos en la elucidación de la naturaleza molecular de los genes.

Para que la transformación de las bacterias con ADN exógeno ocurra, éstas deben estar en un estado de competencia, es decir, debe de ser capaz de captar ADN exógeno del medio ambiente. Por lo que hay dos formas de competencia; natural y artificial. Naturalmente, algunas especies sobre la muerte de sus células liberan el ADN para ser captado por otras células bacterianas. Estas bacterias naturalmente competentes tienen conjuntos de genes que proporcionan la maquinaria proteica necesaria para llevar ADN a través de la membrana de la célula e incorporarlo. Por otra parte, la competencia artificial puede ser inducida con los procedimientos de laboratorio que implican hacer a la célula pasivamente permeable al ADN, exponiéndola a condiciones que no se producen en la naturaleza normalmente. De este modo la transformación involucra tres pasos principales que incluyen; la preparación de células competentes, la introducción del ADN exógeno, así como la selección de los transformantes.

Las células competentes se pueden preparar en el laboratorio a través de métodos químicos o eléctricos. En el primero, el método más común implica el uso de compuestos con cationes divalentes como CaCl2 para aumentar la permeabilidad de la membrana de la bacteria, aumentando la probabilidad de adquisición de ADN. Mientras que, en la electroporación, por ejemplo, las células se someten a una corriente eléctrica, para crear poros en las membranas y así incorporar el ADN exógeno. Independientemente del método de transformación, las bacterias, en su mayoría, después de la transformación tienen la capacidad de reparar la superficie celular, mientras que la presencia de un marcador molecular permite la selección de las células recombinantes, por ejemplo, si el ADN recién adquirido provee resistencia a antibióticos a las células transformadas.

Se cuentan con diferentes métodos que permiten realizar la transformación de bacterias, como los que se muestran a continuación.

Fundamento de la técnica (¿En qué consiste o cómo se realiza?) Ventajas y Desventajas de la técnica. (Aplicación)

Transformación química Diferentes métodos químicos se han establecido para inducir la transformación bacteriana. El más utilizado es con el tratamiento de CaCl2 para E. Coli y PEG (polietilen-glicol) para protoplastos.

Para crear células competentes en el método clásico con CaCl2 se inocula la cepa huésped en caldo LB y se incuba a condiciones determinadas. Se monitorea el crecimiento bacteriano midiendo la densidad óptica en el espectrofotómetro hasta alcanzar la fase log de crecimiento. Se centrifugan las muestras, se lavan, resuspendiendo el pellet en solución de CaCl2 fría.

En métodos modificados para generar células competentes para almacenamiento criogénico resuspenden el pellet bacteriano en solución fría de TFB. El método de PEG se considera más veloz y sencillo, donde se resuspenden el pellet en una solución de TSS fría.

Para la transformación se mezcla la suspensión bacteriana con el ADN plasmídico a transferir. Se coloca la mezcla en un baño de agua caliente a 42ºC durante 30 seg (aprox), provocando el choque térmico que favorecerá la introducción del ADN plasmídico en la célula huésped. Se adiciona caldo LB y se incuban las muestras a 37ºC.

El proceso se lleva a cabo en frío, lo que implica meter continuamente las muestras en hielo. El método clásico con CaCl2 fue el primer método de aplicación general para la transformación de E. coli con ADN plásmido.

Ventajas:

Relativamente sencillo y eficiente, no se requiere de aparatos especializado tal como el electroporador .

Desventajas:

Se requiere la disponibilidad de diferentes soluciones y dedicar tiempo para su preparación.

Al utilizar PEG se reduce la eficiencia de transformación (no apto para construcción de librerías)

Colony to lawn Eficiente para la transformación de E. coli

Una sola colonia de la cepa donante que contiene el plásmido se recoge y se lava con etanol. Se obtiene el pellet y se resuspende en solución de CaCl2, se lisan las células con ciclos de congelación y descongelación repetidos. Al mismo tiempo, se toman las células receptoras de un cultivo fresco en placa con LB y se colocan en hielo. Luego se mezclan estas células receptoras con el lisado celular que contiene el plásmido para la transformación por choque-térmico. Las

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