Preparación de frotis microbiano y observación bajo microscopio óptico

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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERIAS CAMPUS GUANAJUATO

CARRERA: Ingeniería Biotecnológica

UNIDAD DE APRENDIZAJE: Laboratorio de Técnicas Microbiológicas

Segundo semestre

2BM1

Práctica 1. Preparación de frotis microbiano y observación bajo microscopio óptico

Práctica 2. Morfología colonial y celular

Fecha de realización práctica 1: 08 de febrero de 2017

Fecha de realización práctica 2: 10 de febrero de 2017

Práctica 1. Preparación de frotis microbiano y observación bajo microscopio óptico[pic 2]

Objetivos Generales:

        Mediante esta práctica se pretende que los alumnos sean capaces de adoptar habilidad en la preparación de frotis microbiano. Y a partir de estos, realizar tinciones de diferentes microorganismos. Finalmente, manipular con eficiencia el microscopio compuesto óptico para la clara observación de las preparaciones microbianas.

             Objetivos específicos

• Realizar un frotis microbiano de dos microorganismos: Escherichia Coli y Bacillus Subtilis.
• Preparar tinción simple y tinción diferencial de Gram sobre los microorganismos E. Coli y B. Subtilis.
• Entender y saber explicar la diferencia entre una tinción simple y una tinción diferencial de Gram.
• Reforzar los conocimientos sobre los diferentes tipos de microscopios.
• Distinguir las partes de un microscopio compuesto óptico.
• Manejar con habilidad el microscopio compuesto óptico, para observar las preparaciones microbianas de una manera nítida y clara.
• Al realizar la observación al microscopio distinguir si los microorganismos a tratar son Gram positivos o Gram negativos.

Introducción

Las tinciones en el área de microbiología son las principales herramientas que se utilizan para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.  

   Un colorante es aquella sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, entre otros. Químicamente los colorantes están conformados de un componente auxócromo y uno cromóforo. El cromóforo es el grupo aislado covalente o insaturado que tiene la capacidad de que los electrones de la molécula absorban energía o luz visible, se exciten y emitan diversos colores. Los auxócromos son radicales o grupos funcionales de una molécula con una carga parcial positiva; su principal función es intensificar el color, es decir, desplazan a los crómoforos hacia longitudes de ondas largas para aumentar la intensidad (López Jacome, Hernández Duran, Colín Castro, Ortega Peña, Cerón Gonzales & Franco Cendejas, 2014).

   La mayoría de las veces es necesario teñir a los microorganismos por medio de los colorantes para un mejor análisis. De esta manera, las principales funciones de los colorantes en las tinciones son: permiten hacer visibles a los objetos diminutos e incoloros, se puede observar su forma y tamaño, se muestra la estructura interna y externa, y pueden producir reacciones químicas específicas. (López Jacome et al, 2014).

   Los colorantes se dividen en colorantes ácidos y básicos. Los colorantes ácidos son iones negativos y los básicos son iones positivos. Bajo un pH 7.0, las bacterias tienen una carga ligeramente negativa y por lo tanto el ion positivo teñido de un colorante básico es atraído por la bacteria. Cristal violeta, azul de metileno y safranina son algunos ejemplos de colorantes básicos. Los colorantes ácidos no son atraídos por todas las bacterias debido a que, los iones negativos del colorante son repelidos por la superficie bacteriana cargada negativamente. De este modo, el colorante es repelido por la bacteria y colorea el fondo de la preparación. Por lo tanto, a la preparación de bacterias incoloras sobre un fondo coloreado se denomina tinción negativa. Esta tinción es útil para la observación de la morfología externa de las células, del tamaño y de las capsulas, porque las células resultan muy visibles al contrastar con el fondo oscuro. (López Jacome et al, 2014).

   Sin embargo, antes de teñir es importante que los microorganismos sean adheridos o fijados al portaobjetos, de lo contrario, podrían ser eliminados al ser lavados durante la tinción.   A esta etapa se le denomina fijación, la cual tiene la función de preservar la arquitectura estructural y química de las células. Para fijar una muestra debe comenzarse con la extensión sobre el portaobjetos de una delgada capa del material que se desea analizar, llamada extensión. A los procesos de fijación y extensión se les conoce como frotis. Posteriormente, se deja secar al aire, el portaobjetos se pasa lentamente a través del mechero Bunsen varias veces, con el lado de la extensión hacia arriba. En esta parte (flameado) se desnaturalizan (coagulan) las proteínas microbianas y se adhieren los microrganismos al portaobjetos. Se aplica entonces el colorante, lavándolo después con agua y se enjuaga al portaobjetos con la ayuda de un papel filtro, Finalmente, se observa al microscopio (Tortora, J.G., Funke, R.B., Case, L.C., 1993).

Para aplicar los colorantes ácidos o básicos se utilizan tres tipos de técnicas de tinción: simple, diferencial y especial.

Tinción simple:

   Un colorante simple es una solución acuosa o alcohólica de un solo colorante básico. Aunque distintos colorantes se unen específicamente a partes diferentes de la célula, el objetivo primario de una tinción de este tipo es destacar al microorganismo entero, de forma que la morfología y las agrupaciones celulares resulten visibles. El colorante se aplica a la extensión fijada durante un determinado tiempo; después se lava y la preparación se seca y se examina. Algunas veces, se añade un compuesto químico a la solución para intensificar la tinción, lo que se conoce como mordiente. Algunos de los colorantes simples utilizados son: azul de metileno, violeta de genciana y safranina (color de contraste ácido).  Si la preparación se tiñe con safranina, las bacterias adquirirían un color rojo, si por el contrario se tiñen con cristal violeta, las bacterias aparecerán teñidas de color violeta, es decir adquirirán el color del único colorante que se utilizó (López Jacome et al, 2014).

Escherichia Coli: Las colonias de E. coli poseen una apariencia bastante inclasificable. Las colonias redondas mantienen tanto un margen entero (es decir, continuo, liso) como una superficie suave. Comúnmente se clasifica dentro de la morfología como bacilo (Tortora et al, 1993).

Bacillus Subtilis: las esporas son centrales, forma elipsoide y al formarse en el interior de la célula dan lugar al hinchamiento de esta (Tortora et al, 1993).

Tinciones diferenciales

   Estas tinciones dan reacciones distintas con diferentes tipos de bacterias y por lo tanto permiten distinguirlas. Las tinciones diferenciales más utilizadas son la tinción de Gram y de ácido-alcohol resistencia.

• Tinción de Gram

   Desarrollada en 1884 por Hans Christian Gram, la tinción de Gram divide a las bacterias en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas.  Para esta tinción se cubre la extensión fijada por calor con un colorante básico morado, generalmente cristal violeta (colorante básico). Su función es dar un color morado o azul  a toda la preparación se le llama tinción primaria.

Al poco tiempo se lava el colorante y se cubre la extensión con yodo, un mordiente. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del colorante primario con la célula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar el color del teñido. Cuando se lava el yodo  las bacterias Gram positivas y Gram negativas aparecen de un color violeta oscuro o morado. Posteriormente, se lava con etanol (o solución de etanol) y acetona. Esta solución es un agente decolorante que elimina el color morado de las células de algunas especies. El alcohol disuelve los lípidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared más porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de peptidoglicano más fina de las bacterias Gram negativas, mientras que la pared más gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior (Tortora et al, 1993).. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para evitar que pierdan la tinción las células Gram positivas. Se vuelve a lavar y se tiñe la preparación con safranina, colorante básico rojo. Nuevamente se lava, se seca y se examina. Cultivos de más de 24 horas de teñidos pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta – yodo.  

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