Protocolo Enzimas Restricción

Protocolo Análisis De Restricción

Tarea:

Enzimas de restricción son muy útiles en la biología molecular y apliquen en varias técnicas. Durante la practica van a usar enzimas de restricción para identificar y distinguir diferentes plásmidos.

Van a recibir tres tubos Eppendorf (A, B, C) con diferentes plásmidos. Las secuencias de los plásmidos están ajuntadas y corresponden a los siguientes constructos:

KAT1 en pFL61, TASK3 en pFL61 y TASK2 en pFL61

No se sabe cual plásmido se encuentra en cual tubo Eppendorf. Con este experimento se debe averiguar cual tubo contiene cual plásmido analizando los patrones que se generan por digestión con las siguientes enzimas de restricción:

EcoRI, ApaI, NotI y HindIII

El resultado de esta reacción se analizará en un gel de agarosa. El patrón de bandas que genera cada enzima de restricción se compara con los patrones teóricos para poder identificar cual tubo contiene cual constructo.

Para este experimento se requiere la análisis de las secuencias ajuntadas previa del experimento para determinar los patrones teóricos. Este análisis se realiza con la herramienta Virtual Cut de Serial Cloner como enseñado en el curso Biotecnología.

Materiales y Métodos:

Material:

-tres tubos A, B y C con diferentes plásmidos

-enzimas de restricción y sus buffers correspondientes:

Semana 1: EcoRI y ApaI

Semana 2: NotI y HindIII

Digestión con enzimas de restricción:

*Composición de reacción:

0,7μl DNA plasmídico

0,5μl Enzima de restricción

1,5μl Buffer de enzima de restricción

12,3μl H2O

15μl

-incubación por 1 hora a 37°C

Gel electroforesis:

*Preparación gel:

0,5g Agarosa

50ml 1x TAE

-disolver Agarosa en microonda

!!! CUIDADO: EL LIQUIDO ES CALIENTE Y PUEDE SALTAR A LOS OJOS !!!

-deje que se baja la temperatura

-añadir 5μl de GelRed

-verter gel y dejar solidificar

*Preparación muestras:

-mezclar 2,5μl de colorante de carga con los 15μl de muestra

*Cargar muestras y patrón de referencia al gel:

-5μl de patrón de referencia MassRuler

-las muestras completas (=18μl)

-correr el gel con 90V por 45 minutos

-tomar foto

>KAT1 en pFL61

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGATTAATTTTTTTTTCTTTCCTCTTTTTATTAACCTTAATTTTTATTTTAGATTCCTGACTTCAACTCAAGACGCACAGATATTATAACATCTGCATAATAGGCATTTGCAAGAATTACTCGTGAGTAAGGAAAGAGTGAGGAACTATCGCATACCTGCATTTAAAGATGCCGATTTGGGCGCGAATCCTTTATTTTGGCTTCACCCTCATACTATTATCAGGGCCAGAAAAAGGAAGTGTTTCCCTCCTTCTTGAATTGATGTTACCCTCATAAAGCACGTGGCCTCTTATCGAGAAAGAAATTACCGTCGCTCGTGATTTGTTTGCAAAAAGAACAAAACTGAAAAAACCCAGACACGCTCGACTTCCTGTCTTCCTATTGATTGCAGCTTCCAATTTCGTCACACAACAAGGTCCTAGCGACGGCTCACAGGTTTTGTAACAAGCAATCGAAGGTTCTGGAATGGCGGGAAAGGGTTTAGTACCACATGCTATGATGCCCACTGTGATCTCCAGAGCAAAGTTCGTTCGATCGTACTGTTACTCTCTCTCTTTCAAACAGAATTGTCCGAATCGTGTGACAACAACAGCCTGTTCTCACACACTCTTTTCTTCTAACCAAGGGGTGGTTTAGTTTAGTAGAACCTCGTGAAACTTACATTTACATATATATAAACTTGCATAAATTGGTCAATGCAAGAAATAGATATTTGGTCTTTTCTAATTCGTAGTTTTCAAGTTCTTAGATGCTTTCTTTTTCTCTTTTTTACAGATCATCAAGGAAGTAATTATCTACTTTTTACAACAAATATAAAAACCAGCGGCCGCCAGTGTGAGTAATTTAGATAACAAATGGGTCACAACAAGTTGCCATAAAGGTCCCAACAGAAGAAGAAAAGAGAAGTTTCCCCGTGTCACTTTGTCACAAGCTTCATCACTATTTATAACTACCTTGCCAAGAAGAAAGCCTAAAAAGGTATAACAGTTTCTTTGTCTTTAGAGATCATCAAAAAGATGTCGATCTCTTGTACTCGAAATTTCTTCGAAAGATTCTGCGTCGAGGAATACAATATAGACACCATAAAACAGAGTAGTTTCCTCTCTGCCGATCTTCTACCATCTCTTGGAGCCAGGATCAACCAATCTACTAAGCTCCGCAAACACATAATCTCTCCTTTTAATCCACGTTACAGAGCGTGGGAGATGTGGCTAGTATTACTAGTTATTTACTCAGCTTGGATTTGCCCATTTCAATTTGCTTTCATCACCTATAAAAAAGACGCGATTTTCATCATCGACAACATTGTTAATGGCTTCTTCGCCATTGATATTATTCTCACCTTCTTCGTCGCTTATCTCGATAGCCACTCCTATCTTCTAGTTGACAGTCCTAAGAAAATAGCAATAAGGTACCTTTCGACGTGGTTCGCTTTCGATGTTTGTTCCACAGCACCATTTCAGCCACTAAGCCTCTTGTTTAACTACAACGGAAGCGAACTAGGATTCAGAATTCTTAGCATGCTCAGGTTATGGCGTCTCCGGCGAGTTAGCTCGCTATTTGCAAGGCTTGAGAAAGATATCCGTTTCAACTATTTCTGGATACGTTGCACAAAACTCATTTCGGTCACTTTGTTCGCTATACATTGTGCTGGATGTTTCAACTACCTGATTGCAGATAGATATCCTAATCCAAGAAAGACATGGATTGGAGCTGTGTATCCAAATTTCAAAGAAGCAAGTCTATGGAATAGATATGTGACTGCTCTTTACTGGTCCATTACGACATTAACGACCACGGGATATGGAGATTTTCATGCTGAGAACCCAAGAGAAATGCTTTTTGACATTTTCTTCATGATGTTCAACCTCGGTTTGACAGCTTACCTCATTGGAAATATGACCAACCTCGTCGTTCATTGGACTAGCCGAACCAGAACCTTTAGGGATTCAGTGAGAGCTGCTTCAGAGTTTGCTTCAAGAAATCAACTCCCACATGACATAGAAGATCAAATGTTATCACACATTTGCTTAAAGTTCAAAACAGAGGGCTTGAAACAACAAGAGACCTTGAACAATCTGCCAAAAGCAATCCGGTCAAGCATTGCAAACTATTTATTCTTCCCCATTGTTCACAACATTTACCTCTTTCAAGGAGTTTCTCGTAACTTCCTCTTTCAATTGGTTTCAGATATAGACGCTGAGTATTTCCCACCAAAAGAAGATATAATTCTACAAAACGAAGCTCCTACTGATCTTTACATTCTGGTGTCAGGAGCAGTGGACTTCACTGTCTACGTTGATGGACATGATCAGTTTCAAGGGAAAGCAGTAATTGGAGAAACATTTGGAGAGGTTGGAGTTTTATACTATAGACCACAACCATTCACAGTAAGAACAACCGAGCTGTCTCAAATACTACGGATAAGCAGAACATCGCTGATGAGTGCGATGCATGCTCATGCTGACGATGGACGAGTCATCATGAACAATCTTTTCATGAAACTTAGAGGGCAACAGTCAATAGCAATAGATGATTCGAATACTAGTGGTCACGAAAACAGAGATTTCAAAAGCATGGGATGGGAAGAGTGGAGAGATTCAAGAAAAGATGGCTATGGTTTAGATGTTACGAATCCGACTTCCGACACTGCTCTAATGGATGCGATTCACAAGGAAGATACTGAAATGGTTAAGAAGATACTTAAGGAACAAAAGATAGAGAGAGCCAAAGAGGAAAGATCTAGTAGTGAAAGCGCTGGAAGAAGTTACGCTAACGATTCATCGAAAAAAGATCCATATTGCAGCTCAAGCAACCAAATCATCAAGCCATGCAAACGAGAAGAAAAGAGAGTTACCATCCACATGATGTCTGAGAGCAAGAACGGGAAGTTGATACTCGTACCATCATCCATAGAAGAGCTTCTAAGACTTGCAAGTGAGAAGTTTGGAGGCTGCAACTTCACAAAGATCACCAATGCGGACAACGCTGAGATTGATGATTTAAATGTCATTTGGGATGGTGATCATTTGTATTTTTCATCAAATTGAGTTTGAAAACTCGACTTCATTTATAGAGCATGTATATCTGCAGACAATGTATTTTTACCCGGTTTCATAGAAAAGTCTAGATTATCAAAAAAAAAAAAAAAGCGGCCGCCATCAATTTTTTCTTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGCTAAAATAATAGTTTATTTTATTTTTTGAATATTTTTTATTTATATACGTATATATAGACTATTATTTATCTTTTAATAGATTATTAAGATTTTTATTAAAAAAAAATTCGCTCCTCTTTTTAATGCCTTTATGCAGTTTTTTTTTCCCATTCGATATTTCTATGTTCGGGTTCAGCGTATTTTAAGTTTAATAACTCGAAAATTCTGCGTTCGTTAAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCAGATCTGAGCTTTTTCTTTCCAATTTTTTTTTTTTGTGAGTTTAGTATACATGCATTTACTTATAATACAGTTTTTTAGTTTTGCTGGCCGCATCTTCTCAAATATGCTTCC

CAGCCTGCTTTTCTGTAACGTTCACCCTCTACCTTAGCATCCCTTCCCTTTGCAAATAGTCCTCTTCCAACAATAATAATGTCAGATCCTGTAGAGACCACATCATCCACGGTTCTATACTGTTGACCCAATGCGTCTCCCTTGTCATCTAAACCCACACCGGGTGTCATAATCAACCAATCGTAACCTTCATCTCTTCCACCCATGTCTCTTTGAGCAATAAAGCCGATAACAAAATCTTTGTCGCTCTTCGCAATGTCAACAGTACCCTTAGTATATTCTCCAGTAGATAGGGAGCCCTTGCATGACAATTCTGCTAACATCAAAAGGCCTCTAGGTTCCTTTGTTACTTCTTCTGCCGCCTGCTTCAAACCGCTAACAATACCTGGGCCCACCACACCGTGTGCATTCGTAATGTCTGCCCATTCTGCTATTCTGTATACACCCGCAGAGTACTGCAATTTGACTGTATTACCAATGTCAGCAAATTTTCTGTCTTCGAAGAGTAAAAAATTGTACTTGGCGGATAATGCCTTTAGCGGCTTAACTGTGCCCTCCATGGAAAAATCAGTCAAGATATCCACATGTGTTTTTAGTAAACAAATTTTGGGACCTAATGCTTCAACTAACTCCAGTAATTCCTTGGTGGTACGAACATCCAATGAAGCACACAAGTTTGTTTGCTTTTCGTGCATGATATTAAATAGCTTGGCAGCAACAGGACTAGGATGAGTAGCAGCACGTTCCTTATATGTAGCTTTCGACATGATTTATCTTCGTTTCCGGTTTTTGTTCTGTGCAGTTGGGTTAAGAATACTGGGCAATTTCATGTTTCTTCAACACTACATATGCGTATATATACCAATCTAAGTCTGTGCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTCTGTTCGGAGATTACCGAATCAAAAAAATTTCAAAGAAACCGAAATCAAAAAAAAGAATAAAAAAAAAATGATGAATTGAAAAGCCAGATCTGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCATCGATGCATACTTTGTGAACAGAAAGTGATAGCGTTGATGATTCTTCATTGGTCAGAAAATTATGAACGGTTTCTTCTATTTTGTCTCTATATACTACGTATAGGAAATGTTTACATTTTCGTATTGTTTTCGATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTACAATTTTTTTGTCTAAAGAGTAATACTAGAGATAAACATAAAAAATGTAGAGGTCGAGTTTAGATGCAAGTTCAAGGAGCGAAAGGTGGATGGGTAGGTTATATAGGGATATAGCACAGAGATATATAGCAAAGAGATACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAATATTTTAGTAGCTCGTTACAGTCCGGTGCGTTTTTGGTTTTTTGAAAGTGCGTCTTCAGAGCGCTTTTGGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCAAAGCGTTTCCGAAAACGAGCGCTTCCGAAAATGCAACGCGAGCTGCCATCGATGCTCACTCAAAGGTCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC

...