Protocolo para extracción de ADN

Protocolo para extracción de ADN

1. Tomar 1 ml de muestra y centrifugar a 3,000 rpm x 5 minutos. Tirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 570μl de buffer TE.
2. Añadir 50μl de lisozima (10 mg/ml) (NO VORTEX!). Mezclar por inversión. Incubar por 1h a 37°C.
3. Agregar 30μl SDS 20%. Mezclar por inversión. Incubar por 30 min a 37°C.
4. Agregar 50μl de NaCl (5M) y mezclar por inversión. Incubar a 65°C a baño María por 2 min.
5. Agregar 10μl de CTAB/NaCl (Pre calentada a 65°C) y mezclar por inversión. Incubar a 65°C a baño María por 10 min.
6. Extraer la suspensión con 800 μl de la solución coloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Centrifugar a 10,000 rpm x 5 min. Transferir la fase acuosa (sobrenadante 1), en otro tubo Eppendorf.
7. Extraer el sobrenadante 1 con 800 μl de la solución de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1). Centrifugar a 12,000 rpm x 5min. Transferir la fase acuosa (Sobrenadante 2) a otro tubo.
8. Extraer el sobrenadante 2 con 800 μl de la solución de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Centrifugar a 10,000 rpm x 5 min. Transferir el sobrenadante a otro tubo.
9. Añadir 560 μl de isopropanol. Mezclar por inversión. Dejar a temperatura ambiente por 30 min. Centrifugar a 12,000 rpm por 30 min. Remover el isopropanol cuidadosamente.
10. Lavar el pellet con 500 μl de etanol al 70%, invirtiendo el tubo varias veces. Centrifugar a 12,000 rpm por 30 min. Remover el etanol.
11. Secar el pellet a temperatura ambiente. Resuspenderlo en 30μl de agua desionizada.

Adaptado de:

Moore, E., Arnscheidt, A., Krüger, A., Strömpl, C & Mau, M. (2004). Simplified protocols for the preparation of genomic DNA from bacterial cultures. Molecular microbial ecology manual, 1(1), 1-15.

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