Extraccion adn

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Extracción de DNA genómico.

Introducción:

El ADN es el material genético de los organismos vivos, desde las bacterias unicelulares hasta los mamíferos multicelulares En eucariontes, como plantas y animales, el ADN se encuentra en el núcleo, una cámara especializada rodeada de membrana dentro de la célula, así como en ciertos tipos distintos de organelos, se componen de monómeros conocidos como nucleótidos.

Los ácidos nucleicos, macromoléculas compuestas de unidades llamadas nucleótidos, existen de manera natural en dos variedades: ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN).

Cada nucleótido se compone de tres partes: una estructura anular que contiene nitrógeno llamada base nitrogenada, un azúcar de cinco carbonos, y al menos un grupo fosfato. La espinaca como cualquier otro ser vivo posee ADN, por lo cual se optó por utilizar a esta planta

Objetivo:

realizar una extracción d DNA gnómico, utilizando espinacas.

Marco teórico:

para extraer el dna genómico, se utilizan diferentes pasos:

1. Utilizar detergente: el detergente debe contar con las siguientes características; debe tener una cabeza hidrofílica e hidrofóbica, asimismo debe contar con dúo de cil sulfato de sodio (SDS) mediante agitación se rompe la membrana celular y el núcleo. generalmente el 0.5% del producto corresponde al DNA genómico y el 1.0% al plásmido.

Nota: las características descritas se encuentran usualmente en el shampoo convencional.

1. Núcleasis: este paso describe la actividad enzimática en el DNA. requiere cofactores derivados, por ejemplo: iones de calcio y magnesio. generalmente se usan siglas EDTA es un agente quelante de iones metálicos.
2. Histonas: produce una interacción iónica con la cadena del DNA por lo cual se agrega cloruro de sodio para romper dicho enlace iónico, logrando así la disociación de DNA-Histonas.

Resumen:

• romper la pared celular (uso de nitrógeno líquido o proasas).
• añadir detergente (SDS).
• Usar EDTA para quitar la actividad enzimática.
• Utilizar tris-HCl como buffer.

Extracción:

En este proceso se obtienen 3 productos principales (residuos de tejidos celular, proteínas desnaturalizadas y/o enzimas y DNA).

Durante la centrifugación el dna permanece en la superficie (se usa cloroformo o fenol para hacer precipitar, junto con el cloroformo).

Nota: el cloroformo no es soluble en agua.

mediante esta acción se forman 3 fases principales:

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• La primera fase se compone de la fase donde se localiza el DNA solubilizado.
• segunda fase es la mezcla donde se comprende generalmente el fenol y un poco de cloroformo.
• fase 3 se compone el resto de cloroformo y las proteínas precipitadas.

• se usa etanol, en el mejor de los casos Isopropanol, esto se debe a que el DNA no es soluble ningún tipo de alcohol posteriormente se agrega una disolución con alcohol (se agrega agua) la solución debe mezclarse y posteriormente centrifugarse, al final se decanta el alcohol.
• debe agregarse etanol al 70%, se mezcla vigorosamente y también se debe centrifugar, con este paso se eliminan los restos de fenol y minerales.
• La mezcla se suspende en un buffer en RNAasa para poder realizar la hidrólisis del RNA se debe precipitar con ISO propanol posteriormente se lava con alcohol al 70% y finalmente se obtiene el DNA genómico.

Materiales:

• dos recipientes de vidrio de diferente volumen
• Licuadora
• taza medidora
• Cuchara
• tela de pañalina.

Reactivos:

• Espinacas (una taza)
• Papaína (ablandador de carne)
• Agua fría (5-10°C)
• alcohol etílico al 70%.
• cloruro de sodio (Sal de mesa)
• detergente con SDS y EDTA (encontrado en shampoo comercial)

Metodología:

1. se debe llevar al congelador durante 30 minutos una taza de espinacas, previamente lavada.
2. se miden 250 ml de agua, posteriormente se llevan al congelador hasta alcanzar una temperatura de entre 5 y 10 °C.
3. medir 300 ml de alcohol etílico al 70% y llevar al congelador por media hora.
4. pasados los 30 minutos se sacan las espinacas del congelador.
5. a la licuadora se añade la taza de espinacas, 1/8 parte de cloruro de sodio (una pizca) y los 250 ml de agua fría.
6. mezclar a máxima velocidad durante 5 o 10 minutos.
7. con ayuda de tela de pañalina, se filtró la mezcla previamente licuada en un vaso de vidrio.
8. una vez que se filtró toda la disolución, se añade 30 ml de shampoo (con SDS y EDTA), mezclar suavemente, dejar reposar de 5 a 10 minutos.
9. posteriormente verter 1/3 o 100 ml de esta disolución en otro recipiente de vidrio de mayor volumen.
10. añadir una pizca de papaína, y mezclar suavemente.
11. añadir 100 ml de alcohol etílico al 70% frío (el alcohol se vierte de manera suave por las paredes del vaso).
12. utilizar un cotonete y extraer la capa rodeando la superficie. guardar la muestra en una bolsa de plástico y congelar.

Resultados:

Después de unos minutos se observó el DNA de la espinaca, parecido a espuma, tomamos nuestra pequeña muestra, y refrigeramos.

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