PROTOCOLO PARA EXTRACCION DE ADN

PROTOCOLO PARA EXTRACCION DE ADN

Bioseguridad: Considere las normas de seguridad tipo II para manipular los aislamientos y trabaje siguiendo las normas establecidas para el laboratorio en el manual general. El día anterior viabilice los aislamientos y prepare los reactivos como se indica a continuación:

 Aislamientos

• Mantenga los aislamientos en Skim Milk a -70ºC.
• Incube las cepas en agitación constante durante toda la noche en 5 ml de caldo LB más 50ug/ml del antibiótico adecuado para la selección del plásmido.

PREPARACIÓN DE ADN

1. Centrifugue el cultivo a 5.100xG, 10min a 4ºC.
2. Descarte el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200µl de TEG, conteniendo 2mg/ml de lisozima. Deje la suspensión 5min a TA.
3. Adicione 400ul de buffer de lisis, mezcle rápidamente por inversión cinco veces (no vortex).
4. Deje la suspensión en hielo durante 5min (Este tiempo es óptimo para la liberación del ADN, evitando la desnaturalización irreversible del ADN).
5. Adicione 300ul de acetato de sodio 3M (o acetato de potasio 5M) y mezclar por inversión. Deje 5min en hielo.
6. Centrifugue 10min a 15.355xG a 25ºC.
7. Recupere el sobrenadante, pase a un tubo nuevo y adicione 480ul de isopropanol (isopropilo alcohol, alcohol isopropílico o 2-propanol) frío.
8. Mezcle bien por inversión muchas veces. Deje 10min a 4ºC
9. Centrifugue 10min a 15.355xG a 4ºC. El ADN precipita como um pellet blanco.
10. Descarte el sobrenadante, seque a TA por 10min hasta que se evapore el alcohol.
11. Lave el ADN por adición de 1ml de etanol 100%. Mezcle por vortex y deje 5min a TA.
12. Centrifugue a 15.000xG por 5min a 4°C.
13. Descarte cuidadosamente el sobrenadante tanto como sea posible el sobrenadante y deje secar el pellet por 10min hasta que se evapore todo el alcohol.
14. Para resuspender el ADN enadicione 75µl de agua destilada o buffer TE 1X. Una muestra de 5µl es suficiente para ver claramente bandas en un gel de electroforesis.

INFORME DE LABORATORIO (POR GRUPO DE TRABAJO)

1. ¿Qué son las endonucleasas?
2. ¿Cómo previene usted  la contaminación con endonucleasas en la extracción de ADN?
3. ¿Qué función cumple la lisozima, el fenol cloroformo, el SDS, el isopropanol, en la extracción de ADN?
4. ¿Un ADN de buena calidad cómo se observa en un gel de agarosa?

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