QUIMICA ANALÍTICA III Práctica: Cromatografía de Intercambio Iónico

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

QUIMICA ANALÍTICA III

Práctica: Cromatografía de Intercambio Iónico

Instructor: Dr. Javier Cinco

Separación de albúmina de suero bovino en Cellex-D (DEAE-celulosa)

La cromatografía de intercambio iónico separa moléculas basándose en la carga neta de éstas. Ciertos grupos funcionales, cargados negativa o positivamente, son unidos covalentemente a una matriz sólida, produciéndose de esta manera un intercambiador catiónico o aniónico, respectivamente.

• Existen intercambiadores cargados positiva o negativamente.

• Los intercambiadores cargados positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones). Estos intercambiadores se denominan intercambiadores aniónicos

• Los intercambiadores cargados negativamente poseen contra-iones cargados positivamente (cationes) y se les denomina intercambiadores catiónicos 

• Una vez unidas las proteínas al intercambiador, éstas son eluidas agregando concentraciones cada vez más elevadas de sal, comúnmente NaCl, o bien el pH es modificado

 [pic 1]

Selección de Parámetros

 La selección del tipo de intercambiador iónico que sea útil para separar moléculas de interés con resolución óptima y eficiencia, depende de las propiedades de las mismas moléculas. En el caso de moléculas anfotéricas (aquéllas que poseen cargas positivas y negativas simultáneamente) lo que determina la estrategia de su separación es su punto isoeléctrico (pI) y su estabilidad en un rango de pH determinado.

A valores de pH por arriba del pI, la molécula de interés estará cargada positivamente. Por el contrario, si el pH está por debajo del pI, entonces la molécula estará cargada negativamente. Es importante hacer notar que entre más alejado esté el pH del pI de la molécula, más cargas negativas o positivas tendrá ésta y se unirá con mayor fuerza al intercambiador iónico requiriéndose altas concentraciones de sal o grandes cambios de pH para desprender la(s) proteína(s) del intercambiador. Esto último no es deseable.

[pic 2]

Otro aspecto que debe considerarse para seleccionar un determinado tipo de intercambiador iónico es lo que se refiere a su estabilidad. En la imagen de arriba se muestra el pI hipotético de una proteína determinada. Dado que ésta puede unirse ya sea a intercambiadores catiónicos o aniónicos, lo que determinaría finalmente la selección del tipo de intercambiador sería el rango de pH en el cual es estable o exhibe sus propiedades completamente (por ejemplo, actividad enzimática).

En alimentos industrializados, el cambio de pH y la fuerza iónica  ⎯concentración de sales⎯, cambia la densidad de carga y con ello su estabilidad, de tal forma que sus propiedades funcionales (ionización, hidratación, carácter hidrofóbico, actividad enzimática, capacidad para unir otros componentes como lípidos y carbohidratos, etc.) también cambian. Conocer las propiedades iónicas de los distintos componentes de los alimentos que deseamos procesar es importante si deseamos obtener resultados apropiados que convengan a nuestros intereses.

Experimento

Intercambiador Iónico  ⎯ Se empleará un intercambiador aniónico comercial denominado Cellex D, una celulosa que contiene el grupo funcional dietilaminoetil [-O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2] unido covalentemente. La celulosa se prepara de la siguiente manera:  

1. Suspender en NaOH 0.25 N conteniendo NaCl 0.5 M por 30 min (10 g NaOH + 14.61 g NaCl; aforar a un litro). Filtrar en papel Whatman #1.
2. Lavar dos veces con agua deionizada.
3. Suspender en HCl 0.25 N por 30 min (21 ml de HCL al 36.5% de pureza; aforar a un litro). Filtrar en papel Whatman #1.
4. Lavar con 5 volúmenes con agua destilada.
5. Agregar a la columna. Equilibrar con el buffer apropiado (en nuestro caso es fosfato de sodio 0.01 M, pH 7; 2.68 g de fosfato de sodio dibásico en un litro de agua). Esto es tardado. Hay que ser pacientes.

Proteína ⎯ La proteína seleccionada para experimentación es la albúmina de suero bovino, fracción V, la cual tiene un pI de 4.6-4.9 (los reportes varían). Se ha preparado previamente una solución de esta proteína al 0.2% (p/v) en buffer de fosfato de sodio 0.01 M, pH 7.0.

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