MÈTODE RÀPID D’IDENTIFICACIÓ BACTERIANA: EL SISTEMA API
nerea-csPráctica o problema7 de Marzo de 2021
3.169 Palabras (13 Páginas)170 Visitas
- MÈTODE RÀPID D’IDENTIFICACIÓ BACTERIANA: EL SISTEMA API
[pic 1]
El sistema API (Appareils et procédés d’identification)
Aquest és una versió miniaturitzada i estandarditzada dels procediments d’identificació de diferents grups bacterians fabricat per els laboratoris francesos Biomerieux. (API va ser una empresa creada el 1970 per el doctor Bussière, el farmacèutic Cinquabre, Paul & Pierre Montagnon i Henri Labruyère. Posteriorment va ser comprada per la societat Biomérieux). Hi ha altres sistemes miniaturitzats d’altres fabricants, però el de Biomerieux és el més estès. Consisteix en una galeria amb medis de creixement i indicadors adients per a poder identificar els microorganismes. Existeix una gamma força amplia de diferents galeries específiques per a diferents grups bacterians:
- API 20E o el API 10S per identificació d’enterobacteris i altres gram negatius
- API 20 NE per identificació de bacils gram negatius no enterobacteris
- API Staph per identificació d’estafilococs i micrococs
- API 20 C AUX per identificació de llevats
- API 20A per identificació d’anaerobis
- API 20 Strep per identificació d’estreptococs
- etc
El més utilitzat d’aquests és el sistema API 20E que és una versió miniaturitzada i estandarditzada dels procediments d’identificació de les enterobacteriàcies i d’altres gramnegatius relacionats. Consisteix en un mètode de 23 proves bioquímiques que es fan sobre una sola colònia de bacteris que es sembra en 20 microtubs. Aquests tenen els substrats deshidratats i s’inoculen amb una suspensió bacteriana procedent d’un cultiu pur. Els resultats es llegeixen segons el color de la reacció. En alguns casos és necessari afegir reactius al microtub abans de llegir la prova.
Les característiques bioquímiques que s’estudien són les següents:
ONPG | Hidròlisi de l’ortonitrofenol galactòsid per l’enzim ß-galactosidasa, alliberant ortonitrofenol de color groc |
ADH | Activitat arginina dihidrolasa. Aquest enzim transforma l’arginina en ornitina, amoni i CO2. Això produeix un augment del pH i un canvi de l’indicador de groc a vermell |
LDC | Activitat lisina descarboxilasa. Transforma la lisina en una amina anomenada cadaverina que incrementa el pH. L’indicador vira de groc a vermell |
ODC | Activitat ornitina descarboxilasa. L’enzim transforma l’ornitina en una amina anomenada putrescina produint un increment del pH i donant un viratge de l’indicador de groc a vermell. |
CIT | Utilització del citrat com a única font de carboni. Això produeix un augment del pH, i l’indicador (blau de bromotimol) vira de verd a blau. Pot fer-se una prova separada de l’API utilitzant medi citrat en agar inclinat, fent una estria en superfície |
H2S | Producció de sulfhídric a partir de tiosulfat. El sulfhídric reacciona amb sals de ferro que donen un precipitat negre |
URE | Activitat ureasa. Aquest enzim allibera amoníac a partir de la urea, produint-se un augment del pH i l’indicador (roig de fenol) vira de groc a vermell |
TDA | Activitat triptòfan desaminasa. Aquest enzim forma àcid indol-pirúvic a partir del triptòfan. Aquest àcid forma un compost marronós en presència de clorur fèrric. |
IND | Producció d’indol a partir del metabolisme del triptòfan. El reactiu de Kovacs forma un complex |
1
vermell amb l’indol. Si es vol fer com a prova independent, es parteix d’un cultiu en medi nutritiu al qual s’afegeix el reactiu | ||
V-P | Voges-Proskauer. Producció d’acetoïna a partir de glucosa. L’acetoïna en presència d’O2 i àlcali s’oxida a diacetil, compost que reacciona donant colo rosat en aquesta prova. Si la prova es positiva indica que té lloc la fermentació butanodiòlica | |
GEL | Liquació de la gelatina per enzims proteolítics, alliberant un pigment negre que difon a través del tub. | |
GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA | Glucosa Mannitol Inositol Sorbitol Ramnosa Sacarosa Melobiosa Amigdalina Arabinosa | Utilització de diferents glúcids. La seva utilització té com a conseqüència la producció d’àcid, i s’observa una davallada del pH. L’indicador, blau de bromotimol, virarà de blau a groc. La fermentació comença a la part inferior dels tubs i l’oxidació a la cúpula. |
PROVES AFEGIDES A LA GALERIA API 20 E | ||
OX | Prova de la oxidasa | |
NO2 | Reducció de nitrats a nitrits | |
N2 | Reducció de nitrats a nitrogen | |
MOB | mobilitat | |
McC | Creixement en Mc Conkey | |
OF-O | Oxidació de la glucosa | |
OF-F | Fermentació de la glucosa |
PROCEDIMENT OPERATIU
Retolem la galeria API que utilitzarem i vessem 5 mL d’aigua en els pous de la galeria, per a tenir una atmosfera humida.
[pic 2]
Preparem una suspensió del bacteri 0,5 Mc Farland a partir d’un cultiu pur de 24 hores en un medi sense inhibidors (TSA) i s’inocula la galeria API 20E amb una pipeta Pasteur estèril.[pic 3][pic 4]
A l’hora d’omplir els pous cal seguir les instruccions indicades en el dibuix adjunt:
[pic 5][pic 6]
Després d’inocular tots els microtubs seguint les instruccions del requadre, es tapa la cubeta i s’incuba 18- 24 hores a 35-37 °C.
[pic 7]
RESULTATS:
- Desprès de 18 h d’incubació s’anoten les reaccions que no requereixen reactius.
- Si el tub GLU és negatiu (blau o verd), deixarem incubar 24 hores més a la mateixa temperatura.
- Si el tub GLU és positiu (groc) primer s’afegeixen els reactius de les proves TDA i VP als pous corresponents. La reacció del TDA és immediata, mentre que la VP pot trigar uns 10 minuts.
- El reactiu de Kovacs (indol) s’afegeix l’últim perquè es desprenen vapors que podrien donar falsos positius a la reacció VP
- El reactiu de l’oxidasa s’afegeix al tub H2S o ONPG. Aquesta reacció pot donar falsos positius. Val mes fer-la apart amb el mètode tradicional.
- Lectura: els tests estan separats en grups de 3 i cada test té el número 1, 2 o 4. Sumant els números corresponents a les reaccions positives dins de cada grup s’obtenen les xifres que constitueixen el perfil numèric. Aquest es busca en el llibre d’identificació.
REACTIUS
- reactiu per al TDA: solució de clorur fèrric al 10%
- reactiu per al VP (reactiu de Barrit): Consta de 2 solucions:
- solució A: hidròxid potàsic al 40 %
- solució B: alfa-naftol al 6% en etanol absolut. S’ha de preparar cada dues setmanes i es desa a 4
°C en un flascó topazi
- reactiu per a l’indol (reactiu de Kovacs): es prepara dissolent 5 g de paradimetil-amino-benzaldehid en 75 mL d’alcohol amílic, escalfant a 60 °C en bany Maria. Es deixa refredar i s’afegeixen, gota a gota, 25 mL d’àcid clorhídric al 35%. S’obté un líquid de color groc que s’ha de conservar en flascó de color topazi, a 4 °C i a les fosques.
- reactiu de l’oxidasa: és una solució aquosa a l’1 % de tetrametil-p- fenilendiamida. Aquest reactiu, acabat de preparar, és incolor o lleugerament rosat. Com que és fàcilment oxidable s’ha de
guardar a 4 °C, en un flascó topazi amb tap esmerilat i ales fosques. L’autooxidació es retarda bastant i s’afegeix un 0,01% d’àcid L-ascòrbic. Alguns fabricants el presenten de forma que està impregnant tires de paper, i no en format líquid.
...