AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS Y CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILA

AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS Y CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILA

INTRODUCCION

El aislamiento de organelos celulares por centrifugación diferencial es una técnica muy valiosa para el estudio de la morfología, bioquímica y fisiología de los elementos que conforman a las células,  se requiere de aparatos como la centrifuga refrigerada para asegurar el buen estado de los organelos durante el aislamiento, pero se pueden separar fracciones ricas en determinados organelos, utilizando la centrifuga clínica.

Los cloroplastos son los organelos encargados de realizar la fotosíntesis, en plantas, algas y protozoarios. Este proceso consiste en sintetizar azucares utilizando la energía luminosa, que puede captar gracias a pigmentos como las clorofilas que se encuentran incluidas en las membranas tilacoidales de los cloroplastos. Las concentraciones de clorofilas “a” y “b” varían de acuerdo a las especies y puede determinarse mediante técnicas espectrofotométricas basadas en la ley de Beer y Lambert, sin necesidad de aislarlas y purificarlas lo cual es lento y difícil debido a la naturaleza de la sustancia misma y a limitantes de carácter técnico.

OBJETIVO

1.- Que el alumno evalúe importancia de la centrifugación diferencial como técnica para separar componentes celulares para su posterior estudio

2.- Que determine la concentración de clorofila “a” y “b” en una muestra de cloroplastos utilizando el espectrofotómetro y aplicando la ley de Beer.

3.-Que el alumno compare las proporciones de clorofilas “a” y “b” en diferentes especies

MATERIAL

2 vasos de precipitados de 250 ml

1 mortero con pistilo,  previamente fríos

3 pipetas de 5 ml

3 pipetas de 1ml

1 embudo pequeño de vidrio

1 piseta con agua destilada

1 probeta de 50 ml

Gasa y papel filtro

APARATOS
Balanza granataria de dos platos

Balanza granataria de un plato

Centrifuga clínica

Microscopio óptico

REACTIVOS

Solución de NaCl a 0.35 M

Solución amortiguadora tris-HCl 0.2 M pH 8

Acetona al 80%

50 gr aproximadamente de hojas frescas y verdes* (espinacas, acelgas)

DESARROLLO

1.- Lave las hojas con agua corriente y sacudirlas perfectamente

2.- Manténgalas en frio dentro de una bolsa de plástico obscura para asegurar su turgencia

3.- Remueva las nervaduras más grandes y pesar 30 g.

4.-Corte fragmentos pequeños y molerlos en un mortero con 60 ml de solución de  NaCl 0.35M y 10 ml de solución amortiguadora.

5.- Macere firmemente por un periodo no mayor de 4 minutos (si lo juzga a necesario macerar en dos partes). Coloque el mortero sobre el hielo para inactivar las enzimas hidrolíticas que se liberan durante la ruptura celular.

6.- Filtre sobre cuatro capas de gasa, recuperando el homogenizante en el vaso de precipitados.

7.- Antes de centrifugar es necesario equilibrar el peso de  los tubos en la balanza granataria de dos platos.

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