PRÁCTICA 1 AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE DNA GENÓMICO

PRÁCTICA 1

AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE DNA GENÓMICO

ÍNDICE

• INTRODUCCIÓN.
• OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA.
• MATERIALES.
• PROTOCOLO A SEGUIR PARA SU REALIZACIÓN.
• RESULTADOS.

• Esquema.
• Cálculo de concentración y pureza.

• CONCLUSIÓN.
• BIBLIOGRAFÍA.  

INTRODUCCIÓN.

        Para aislar el DNA cromosómico de gran peso molecular es necesario que las paredes y membranas celulares se rompan previamente a un proceso de purificación y precipitación de sus ácidos nucleicos, para finalizar con su cuantificación y la determinación de su nivel de pureza.

        Esta práctica tiene como objetivo el aislamiento de ácidos nucleicos (DNA) a partir de tejido animal (hígado de ternera en este caso).

        Para determinar la cantidad y pureza de los ácidos nucleicos se utiliza el espectrofotómetro, un aparato que nos permite observar la radiación que el extracto absorbe o emite, o que nos permitirá ver si la muestra de ADN es lo suficientemente pura para ser aceptable o por el contrario no lo es y ha sido contaminada durante el proceso por fenol o proteínas.

        Para hallar la concentración y pureza introduciremos 100 ml de la solución en una cubeta junto con 900 ml de TE en el espectrofotómetro a dos diferentes longitudes de onda una a 280 nm y otra a 260 nm que nos darán dos absorbancias que utilizaremos para determinar la cantidad y pureza de la muestra.

OBJETIVO.

El objetivo de un proceso de aislamiento y purificación de DNA es conseguir separar esta molécula del resto de las macromoléculas presentes en el interior de las células y ver la cantidad y pureza del DNA obtenida utilizando un aparato llamado espectrofotómetro a diferentes longitudes de onda (260nm y 280 nm).

MATERIALES.

Para esta práctica utilizaremos aparte de los reactivos que luego pondré una serie de pipetas reguladas y ordenadas en colores según su volumen, boquillas para pipetas, 1g de hígado de ternera, varios eppendorf, hielo, homogeneizador de embolo y tubo, speedvac, vaso de precipitados, espectrofotómetro y  pinzas de disección.

También utilizaremos varios reactivos: 20µl de SDS al 10%, 50µl de acetato sódico 3M, 2 volúmenes de SEVAG (Cloroformo: isoamilalcohol (24:1)) y otros dos de etanol 90%, 1ml de etanol 70%, 2300µl de TE (Tris-HCl 50 mM/EDTA 1 mM pH: 7,5) y 3 ml de tampón homogeneizador (Tris-HCl 50 mM pH: 7,6/EDTA 100 mM)

PROTOCOLO A SEGUIR PARA SU REALIZACIÓN.

        Para conseguir el correcto aislamiento del ADN de 1 g de hígado de ternera primero debemos introducir este gramo en un homogeneizador y añadir 3ml de tampón de homogeneización. Un segundo paso sería introducirlo en hielo y homogeneizarlo por fricción en un homogeneizador de embolo y tubo y dejarlo reposar aproximadamente unos 10 minutos.

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