ARN PROCEDIMIENTO DE EXTRACCION

Anexo: Cuestionario

1.- ¿Qué pasa con las células en la primera incubación a 37°C?

En los pasos anteriores de la transformación las células fueron maltratadas por la temperatura para crear poros para la introducción del plásmido mientras que en esta etapa se le da un “descanso” a la célula, dándole nutrientes y una temperatura a la que pueda repararse, integrar el plásmido y crecer. [2]

2.-Menciona dos técnicas diferentes para introducir genes a células bacterianas.

Preparación de células electro competentes: Este método se basa en la obtención de células libres de iones. Para ello un cultivo en fase logarítmica (OD entre 0.5 y 0.7) se lava sucesivas veces con H2O (tipo MiliQ) o con una solución de glicerol al 10%, aproximadamente 4-5 veces. Posteriormente la mezcla ADN/células se somete a cortos pulsos de corriente eléctrica de alto voltaje, lo cual altera las envolturas y permite la captación de ADN en una amplia variedad de bacterias, tanto Gram1 positivas como Gram-negativas. Este método es más eficiente para la incorporación de ADN dentro de las células.

Tratamiento con cloruro de calcio: los iones del metal y los cambios bruscos de temperatura (golpe de 42°C) alteran la permeabilidad de la pared celular, lo que hace que las células permitan la entrada de ADN exógeno a través de la membrana celular, ya que son bastante frágiles las células competentes.[3]

3.- Plásmido pGlo

Contiene el gen de beta-lactamasa que codifica para una proteína de resistencia a ampicilina (Ampr). El plásmido pGLO contiene también el gen para la síntesis de la proteína GFP, además contiene un sistema especial de regulación de genes que se puede usar para controlar la expresión de la proteína fluorescente en las células transformadas. El gen para sintetizar GFP se puede activar en las células transformadas simplemente añadiendo arabinosa al medio de cultivo. La selección de las células que se han transformado con el plásmido pGLO se realiza observando el crecimiento en placas con antibiótico. [4]

4.- Plásmido pEF6+

Todos los vectores pEF o pUB contienen un promotor fuerte para expresión de alto nivel en células de mamífero, una elección de marcador de selección para generar líneas celulares estables y una etiqueta de epítopo para fácil detección con un anticuerpo monoclonal y purificación rápida en resina quelante de níquel. Cada vector está disponible en tres marcos de lectura para simplificar la clonación en marco con la etiqueta de fusión. [5]

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