EXTRACCIÓN Y VISUALIZACIÓN DE ARN

II. EXTRACCIÓN Y VISUALIZACIÓN DE ARN

Método Trizol®

RESUMEN.

Existen una gran diversidad de métodos que se pueden utilizar para la extracción y visualización de ARN.

En la presente práctica se purifico ARN de muestras vegetales de Helecho, implementando el método de TRIzol®. Se comprobó que este mantuvo la integridad de ARN durante las etapas que el método conlleva. Culminando en el aislamiento de ARN puro de una de las muestras tratadas por este método.

En la técnica la muestra se macera para que las células del tejido vegetal estén más expuestas a los reactivos y asegurar la obtención de ARN. Al adicionar cloroformo seguida de la centrifugación la mezcla se separa en tres fases; la inferior que es una fase de tinción roja donde se encuentra el cloroformo-fenol, una fase intermedia incolora y la fase acuosa en donde exclusivamente permanece el ARN. El ARN que se encuentra en la fase acuosa es recuperado por precipitación incorporando alcohol isopropílico a esta fase.

La ventaja de este método es que después de que el ARN es removido de la fase acuosa, tanto el ARN como las proteínas que se encuentran en las otras fases pueden ser recuperadas de la misma manera que este, es decir por medio de la precipitación de Alcohol isopropílico.

Este proceso es efectivo tanto en tejido animal como vegetal, esto indica que es un método de gran utilidad para la implementación en el laboratorio de biología molecular obteniendo muy buenos resultados.

Como es de esperarse al estar trabajando con elementos tan frágiles como lo es el ARN, el procedimiento se debe realizar bajo rigurosas condiciones ya establecidas, teniendo la precaución de tomar tiempos, temperaturas y técnicas adecuadas, para asegurar el buen manejo y la obtención y aislamiento del ARN lo más puro posible.

En esta práctica solamente se consiguió la observación del ARN de una de las muestras, ya que no se mantuvo la integridad del otro debido a que la técnica fue realizada incorrectamente, pero el resultado de la otra muestra es suficiente para indicar que este método es eficaz para el aislamiento de ARN siepre y cuando se realiza apropiadamente.

INTRODUCCIÓN.

El ARN es uno de los dos ácidos nucleicos existentes, este está formado por una sola cadena, lo constituyen nucleótidos de ribosa, sus cuatro bases son A, G, C y U. El ARN es la molécula que media las etapas de la síntesis de proteínas.

Existen tres tipos de ARN:

ARNm: Es el molde a para la síntesis de proteínas.

ARNt: Transporta los aminoácidos hacia los ribosomas para la síntesis de proteínas.

ARNr: Se encuentra en el ribosoma, participa en la traducción de proteínas.

Este ácido nucleico puede ser extraído de cualquier material biológico, existiendo una gran diversidad de métodos especializados para este propósito, permitiendo la obtención de ARN con un elevado nivel de pureza, alto rendimiento de la muestra, así como también una máxima velocidad de obtención de este.

Método Trizol®

Este método fue puntualizado en 1987 por Chomezynski y Sacchi, en una revista llamada Analytic Bichemistry número 162.

El TRIzol® es el nombre comercial del reactivo TRI, compuesto por una solución:

 Tiocianato de guanidina.

 Tiocianato de amonio.

 Fenol, que es un compuesto volátil y tóxico.

 Hidroxiquinoleína, que participa en la inhibición de ARN-asas.

Estos componentes permiten separar en su totalidad el ARN de las células de la muestra en un solo paso de extracción. El proceso brinda la extracción de ARN, ADN, proteínas y los componentes que pudieran estar presentes en la muestra. Es aplicable tanto para tejidos vegetales como tejidos animales, por lo tanto su implementación en el laboratorio de biología molecular es de gran utilidad.

NOTA: El TRIzol® debe ser almacenado en un recipiente no transparente y se debe envolver en papel de aluminio, ya que este es sensible a la luz. Debido a que sus componentes son volátiles se debe mantener a temperatura por debajo de la ambiental para evitar su evaporación.

El proceso de extracción se compone de una serie de etapas:

Homogenización de la muestra.

o El TRIzol® rompe y degrada las células y componentes de la muestra, manteniendo la integridad del ARN durente el proceso de homogenización de la muestra.

Fase de separación.

o Para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas, se incuba la muestra a temperatura ambiente por 5 minutos. Se les agrega cloroformo y se agita vigorosamente, posteriormente las muestras se centrifugan. La mezcla se separa en tres fases; la inferior es una fase roja de cloroformo-fenol, una fase intermedia incolora y la fase acuosa en donde se encuentra el ARN, esta última es separada y se coloca en un contenedor limpio.

Aislamiento de ARN.

o A la fase recuperada se le adiciona alcohol isopropilico por cada ml de TRIzol®, guardando la muestra a baja temperatura toda la noche para aumentar el sedimento de precipitación. Finalmente se centrifuga a 1000 rpm a 4° C x 30 min. Observándose un precipitado tipo gel.

Lavado de la pastilla ARN.

o Se descarta el sobrenadante, se lava el precipitado con etanol al 75% y se centrifugan a 7500 rpm x 5 min a 4° C para mantener la integridad de4l ARN.

Resuapensión de la pastilla de ARN.

o Se resuspende la pastilla en agua libre de ARN-asa o SDS. Para que prevalezca la integridad.

MATERIAL Y METODO.

A. Protocolo de extracción de ARN

Homogenización de muestras

1. Pesar 0.5 g (± 0.01 g) de material vegetal y envolverlo en papel aluminio etiquetado previamente.

2. Colocar la muestra envuelta en papel aluminio en el tanque de nitrógeno líquido por 10 a 15 minutos.

3. Macerar inmediatamente

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