PRÁCTICA 2 EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL

PRÁCTICA 2

EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL

INTRODUCCIÓN

El ácido ribonucleico es una de las 3 principales macromoléculas que son esenciales para todas las formas de vida, y al igual que el ADN está formado de una cadena larga de nucleótidos.  Existen varios tipos de ARN, pero las tres grandes clases son los implicados en la traducción de proteínas: ARN mensajero, ARN de transferencia, ARN ribosomal. El ARN mensajero representa del 3 al 5% del ARN total celular, el ARN de transferencia representa del 5 al 7%, y el ARN ribosomal va del 85 al 90%.

La extracción de ARN total se puede realizar por 3 metodologías principales: a) extracción mediante solventes con el reactivo TRIzol (Piotr & Sacchi, 1987); mediante columnas de intercambio aniónico de sílice (Kumar & Garg, 2005); y mediante perlas magnéticas (Berensmeier, 2006) .

OBJETIVO

Obtención de ARN de calidad molecular para la producción de ADNc de genes específicos.

MATERIALES Y REACTIVOS

• Trizol
• H2O DEPEC
• Isopropanol GM (frío)
• Etanol GM 75%
• Cloroformo
• Muestra de células
• Microcentrífuga
• Micropipetas 10 μL, 100 μL, 1mL
• Puntillas amarillas y azules
• Microtubos
• Hielo

METODOLOGÍA

1. Por cada 300μL de muestra añadir 700μL de Trizol y homogenizar por inversión. Utilizar vórtex si es necesario (sangre completa debe ser diluida 1:1 con H2O).
2. Incubar de 15-30°C (T.A) por 5min.
3. Añadir 200µL de cloroformo, mezclar por inversión e incubar 15-30°C durante 5min.
4. Centrifugar a 12,000 rpm por 10 min a 4°C.
5. Trasferir la fase acuosa a un microtubo (1.5ml) limpio (la fase orgánica puede servir para aislar el DNA).
6. Añadir 500µL de isopropanol G.M. 100% para precipitar el RNA e incubar de 15-30°C por 5 min.
7. Centrifugar 12000g por 10 min a 4°C. RNA forma pellets gelatinosos que pueden no verse a simple vista.
8. Remover el sobrenadante y lavar con 1mL de etanol G.M. al 75% (o 70%), mezclar en vórtex y centrifugar a 10,000rpm por 5 min a 4°C.
9. Remover el sobrenadante, dejar evaporar el etanol:
10. Dejar tapa abierta 5-10 min T.A.
11. Resuspender el RNA en 30μL de H2O libre de RNAsas (DEPEC).
12. Incubar por 10 min a 55-60°C.
13. Almacenar a -80°C.

RESULTADOS

Tabla 1. Datos registrados por análisis de absorbancia de las muestras de ARN extraído del Grupo 443 y 444

DISCUSIÓN

La extracción de ARN total basada en sus características fisicoquímicas dio como resultado una concentración total de 112.4 ng/μL, con una relación de absorbancia A260/280 de 1.47. De acuerdo a Gott M. (2007) para considerar la calidad del ARN extraído como una muestra pura debe mostrar valores entre 1.8 y 2 en la absorbancia A260/280 valores inferiores solo denotarían contaminación por compuestos aromáticos, este resultado puede deberse a la solución Trizol compuesto por una monofase de fenol – isotiocinanato de guanidinio utilizado para la extracción de ARN,  Rio D.(2010) expone que esta solución es ventajosa en situaciones en las que el tejido esta enriquecido por RNAsa; El ingreso de cloroformo nos provoca una separación de fases, precipitando las proteínas y el ARN permanece en la fase acuosa, este compuesto es el encargado de la eliminación de los polifenoes en la extracción(Hernadez G.,etc al ,2013). Se deduce por tanto que la fase no fue limpia correctamente y su trasferencia al microtubo limpio contenía polifenoles. Por su parte las absorbancia a A260/A230 registraron una valor de 0.26 inferior al dictado por Orfae A.(2011), el cual expone que valores  mayor a 1.7 son considerados como una extracción de calidad, corroborándose así  una contaminación de la muestra obtenida; Comparando las absorbancias obtenidas por el grupo 443 el cual uso como precipitado el isopropanol estándar o normal denoto una leve variación con las absorbancias del grupo 444 el cual utilizo ispropanol de grado molecular, afirmando que este último permitió una mayor precipitación de los ácidos nucleicos  de mayor calidad calculando una aumento aproximado de absorbancia de .20, finalmente al obtenerse la precipitación de ARN este se resuspendió en agua libre de ribonucleicas (DEPEC) para su almacenamiento y posteriores análisis, Chirgwin.J(1979) dicta que el uso del Dietilpirocarbonato en agua es una forma de almacenamiento para el ARN por ser muy susceptible a la degradación por las enzimas ribonucleasas .

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