ASPECTOS DE LA REGULACIÓN DEL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO

Maffrand, Leticia                   Comisión 06                          10/05/2015

MÓDULO III

ASPECTOS DE LA REGULACIÓN DEL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO

PARTE A

Objetivo:

Demostrar la variación del glucógeno hepático en ratas sometidas a distintas condiciones experimentales.

Se usarán hígados obtenidos de ratas normales sometidas a las siguientes condiciones:

• Alimentadas normalmente
• Sometidas a ayuno

Materiales y métodos:

Según Guía de Trabajos Prácticos 2018. Cátedra de Química Biológica Superior. Facultad de Farmacia y Bioquímica – UBA.

Hígado de rata normal o ayunada

[pic 1]

Lavar con SF a 4º C, secar y pesar

[pic 2]

Cortar el hígado y triturarlo con arena lavada y KOH 30%

Mantener en frío

HOMOGENIZAR

[pic 3]

Incubar 20 min a 100º C y pasar a tubo centrifuga, luego enfriar en hielo

[pic 4]

Centrifugar 10 min a 3000 x g

[pic 5][pic 6]

                                   Sobrenadante                         Pellet (Descartar)

[pic 7]

Precipitar el Glucógeno con etanol               Centrifugar 10 min a 5000 x g[pic 8]

[pic 9][pic 10]

                                                            Pellet                        Sobrenadante[pic 11]

                                                                                               (Descartar)

                        Resuspender en H2Od

         (10 ml/g de hígado para ratas normales y 0,3ml/g para ratas sometidas a ayuno)

[pic 12]

                                    Agregar 0,6ml de HCl 2M / 0,4ml sc y calentar 30 min a 100º C

[pic 13]

Reacción de

Somogyi-Nelson                                  Neutralizar con 1 ml NaOH 1,2 M[pic 14]

Por qué usamos KOH?

Por qué usamos HCl?

Resultados

• Tabla 1: Curva de calibración (Espectrofotómetro Nº2)

• Gráfico 1: Curva de calibración

[pic 15]

• Tabla 2: Absorbancia de la muestra según las condiciones de la rata N6*

*Los µmoles de glucosa no pudieron ser calculados ya que están fuera de la linealidad de la curva de calibración del espectrofotómetro. No, tu blanco lo tomas como cero, con lo cual los valores del tubo 6 y 7 entran dentro de la curva igual. Tendrías que haberlos usado en la ecuación de la curva para ver cómo te daban los umoles de glucosa y ahí ver si descartabas o no .

• Tabla 3: Contenido promedio y desvío estándar de glucógeno % en hígados de las diferentes muestras y condiciones.

• Gráfico 2: Comparación de promedios y sus respectivos SD para las condiciones N6, N5 y A4

[pic 16]

PARTE B

Objetivo:

Determinar la actividad in situ de la glucógeno fosforilasa (GP) utilizando electroforesis en geles no desnaturalizantes (PAGE nativo). Comprar el efecto de moduladores sobre la GP hepática y muscular.

Materiales y métodos:

Según Guía de Trabajos Prácticos 2018. Cátedra de Química Biológica Superior. Facultad de Farmacia y Bioquímica – UBA.

Hígado de rata normal

[pic 17]

Lavar con SF a 4º C, secar y pesar

[pic 18]

Cortar el hígado y triturarlo con arena lavada y buffer de homogeneización

Mantener en frío

[pic 19]

Centrifugar 15min a 500 x g (4º C)

[pic 20][pic 21]

                           Pellet  (Descartar)                            Sobrenadante* (conservar en frío)

[pic 22]

Diluir con buffer de siembra 1:1

[pic 23]

Sembrar 0,1 ml muestra en gel de poliacrilamida al 7,50% (con almidón 0,5%)

[pic 24]

Electroforesis 100-120 V

[pic 25]

Colocar el gel en buffer de reacción con AMP-5’ y con cafeína por separado.

Incubar a 37º C ON

[pic 26]

Lavar. Agregar solución reveladora I-/I2

(LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA SE VISUALIZA POR TINCIÓN NEGATIVA)

Qué contiene el buffer de homogeneización?

Qué contiene el buffer de reacción?

*A partir de este punto se repite lo realizado con 25 µgramos de GP muscular comercial.

Resultados:

• Figura 2: Esquema de los resultados observados luego de hacer la tinción Coomasie Blue e I-/I2 para las distintas condiciones.

[pic 27]

PARTE C

Objetivo:

Estudiar la regulación de la GS en levaduras modificadas genéticamente.

Materiales y métodos:

Según Guía de Trabajos Prácticos 2018. Cátedra de Química Biológica Superior. Facultad de Farmacia y Bioquímica – UBA.

[pic 28]

Discusión:

En individuos sanos luego de la ingesta de alimentos, la insulina estimula el ingreso de glucosa a la célula para disminuir la glucemia. Esta hormona, liberada por las células β pancreáticas, es de origen peptídico y favorece el ingreso de glucosa a las células musculares y adiposas; además de favorecer su almacenamiento como glucógeno en el hígado, que representa una importante reserva de glucosa para el organismo. En este proceso, denominado glucogenogénesis,  se inhibe la cascada de las quinasas, la cual culmina con la fosforilación y activación de la glucógeno fosforilasa (GP), así se inhibe la activación de la GP, permaneciendo en la forma menos activa  (GPb). Del mismo modo, la insulina también activa a la fosfoproteína fosfatasa 1 (PP1) que desfosforila tanto a la GP como a la glucógeno sintasa (GS), transformando a esta última en la forma más activa (GSa), generando como efecto neto de la insulina la activación la glucogenogénesis e inhibición de  la glucogenólisis.

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