Actividad Enzimatica

LABORATORIO Nº5

CINÉTICA ENZIMÁTICA I: EFECTO del pH y de la TEMPERATURA.

1. Aspectos teóricos.

Las enzimas son proteínas que presentan actividad catalítica específica, esto es, aumentan la velocidad de reacciones específicas. La actividad catalítica de una enzima es una propiedad que se mide por el aumento de la velocidad de reacción en presencia de la enzima con relación a la reacción no catalizada en un sistema químico dado.

La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la concentración del producto o la disminución de la concentración del sustrato de la reacción en el tiempo.

v = - d[S]/dt = + d[P]/dt

Existen diferentes métodos que permiten cuantificar la concentración de reactantes y/o productos. Entre los métodos analíticos físicos destacan los ópticos, que se basan en la absorción de radiación electromagnética en la región visible y ultravioleta. Determinando el coeficiente de extinción de un compuesto se estima la velocidad sobre la base de las medidas experimentales de absorbancia a un tiempo dado.

Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores más importantes son: concentración de enzima, concentración de ligandos (sustratos, productos, inhibidores y activadores), pH, fuerza iónica y temperatura.

La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. En general, son sólo activas en un rango limitado de éste, observándose en la mayoría de los casos una zona de pH óptimo y una disminución de la actividad a ambos lados del pH “óptimo”. El efecto del pH en la actividad enzimática se debe fundamentalmente a cambios en el estado de ionización de los componentes del sistema; esto puede darse en la enzima libre, en el complejo E-S o en el sustrato. En la zona de pH óptimo predomina la forma iónica activa, a valores de pH menores y mayores su proporción disminuye, aumentando la proporción de formas iónicas no activas; a causa de ello la curva de velocidad versus pH tiene aproximadamente la forma de una campana. El pH no sólo afecta la actividad de las enzimas, sino que también la estabilidad, lo que contribuye a la disminución de la actividad generalmente a valores extremos de pH.

Las reacciones enzimáticas están fuertemente afectadas por la temperatura. Hay dos factores determinantes, el efecto de la temperatura en las constantes de velocidad de la reacción y el efecto de la temperatura en la estabilidad de la enzima. Como es de esperar, un aumento de la temperatura aumenta la velocidad de la reacción; sin embargo, sobre cierta temperatura hay inactivación de la enzima que lleva a una disminución en la velocidad. La zona de temperatura en la cual se observa mayor actividad se conoce como “temperatura óptima”, ésta tiene sólo valor operativo, ya que depende de una serie de factores, como el pH y el tiempo de reacción.

En este práctico se verá el efecto que produce en la actividad de la enzima -glucosidasa de almendra dulce los cambios de pH y temperatura. Se determinará la velocidad de la hidrólisis de un sustrato artificial, el p-nitrofenil--D-glucopiranósido (pNPG), midiendo la formación de un producto de la reacción, el p-nitrofenolato, que en un medio alcalino es de color amarillo y presenta un máximo de absorción alrededor de 405 nm.

Ecuación 5.1

A = Absorbancia

C o = absorbancia del ensayo control

 ·  = pendiente curva de calibrado

t = tiempo (minutos)

V = volumen de ensayo (ml)

v = volumen de enzima (ml)

fd = factor dilución en el ensayo enzimático (en ensayos discontinuos)

fe = factor de dilución de la enzima previo al ensayo enzimático.

Una unidad internacional (UI) de enzima se define como la cantidad que cataliza la formación de 1 mol de producto por minuto en condiciones definidas de ensayo.

2. Objetivos.

Estudiar el efecto del pH y de la temperatura en la velocidad de la hidrólisis del p-nitrofenil--D-glucopiranósido catalizada por la -glucosidasa de almendras. Establecer condiciones adecuadas de ensayo.

3. Parte experimental.

3.1 Materiales

• espectrofotómetro / celdas

• 1 cronómetro

• 1 trípode / rejilla/ mechero

• 1 termómetro

• 1 baño termostatizado

• 1 vaso precipitado de 500 ml

• 1 vaso precipitado de 250 ml

• 2 gradillas

• 20 tubos de ensayo

• 1 pizeta

• 1 pipeta graduada de 1 ml

• 1 pipeta graduada de 2 ml

• 1 pipeta graduada de 5 ml

• plato poroso.

3.2 Reactivos

• p-nitrofenolato 0,2 mM.

• tampón acetato 50 mM, pH 4,0; 5,0 y 6,0.

• tampón fosfato 50 mM, pH 7,0.

• p-nitrofenil--D-glucopiranósido 2 mM / tampón.

• -glucosidasa de almendras (baño agua / hielo).

• Na2CO3 1.0 M.

4. Procedimiento.

Obtención del coeficiente de extinción milimolar del p-nitrofenolato (pNF).

De acuerdo a la tabla 5.1:

• Prepare una batería de tubos rotulados.

• Agregue el volumen indicado de la solución de p-nitrofenol (0,2 mM) a los tubos 2S  7S.

• Complete el volumen a 1,0 ml a cada tubo (1B,

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