Aislamient De Adn

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL EN ORGANELOS CELULARES

I. INTRODUCCION

La separación de líquidos y partículas insolubles se ha dado en la naturaleza desde que se formó el universo. La aplicación de una fuerza centrífuga ayuda a la separación y este proceso se ha venido aplicando recientemente. La separación de partículas por medio de la centrifugación tuvo aplicaciones en procesos industriales hasta hace aproximadamente 100 años. Los primeros usos fueron en la manufactura del azúcar y en separar la crema de la leche. Las primeras separaciones de partículas usando centrifugación fueron probablemente inventadas en 1877 por el ingeniero sueco Carl Gustaf Patrik De Laval para separar crema de leche, estas centrífugas funcionaban a velocidades de hasta 3 000 r.p.m.

II. OBJETIVOS:

 Obtener homogenizados del hígado de pollo

 Separar fracciones subcelulares del homogenizado de hígado de pollo mediante el proceso de centrifugación diferencial.

III. MARCO TEORICO

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL O PELLETING

En este método, el tubo de la centrífuga es llenado inicialmente con una mezcla uniforme de la solución de la muestra, a través de la centrifugación se obtiene una separación de dos fracciones: Un pellet (sedimento) que contiene la partícula sedimentada y un sobrenadante con la fracción no sedimentada de la solución. Un particular componente puede terminar en el sobrenadante o en el pellet, o podría estar distribuido en ambas fracciones, dependiendo de su tamaño y/o de las condiciones de centrifugación. El pellet es una mezcla de todos los componentes sedimentados y está contaminado con cualquier partícula no sedimentada que estuviera en el fondo del tubo. Las dos fracciones son recuperadas por decantación de la solución sobrenadante del pellet. El sobrenadante puede ser recentrifugado a altas velocidades para obtener una mayor purificación con la formación de nuevo pellet y sobrenadante. El pellet puede ser resuspendido en un pequeño volumen y recentrifugado dependiendo de lo que se desee separar.

IV. MATERIALES

 Centrifuga.

 Tubos de ensayo

 Pipetas graduadas.

 Vasos de precipitado.

 Mortero.

 Pipeta

 Microscopio

 Licuadora

 Portaobjetos

 Cubreobjetos

MATERIAL BIOLOGICO

 Hígado de pollo

 Hojas de elodea

REACTIVOS

 Buffer de separación (buffer de fosfatos 10mM y de cloruro de sodio 0.15M, Kcl 3.3Mm y MgCl 2,6 Mm a PH 7,4)

 Azul de metileno

 Azul de bromotimol

V. PROCEDIMIENTO

TÉCNICA:

A. Técnica para centrifugación celular. Fraccionamiento celular.

1. El hígado se enjuaga con agua de caño y se coloca en un vaso de precipitado, que

contenga 20 ml del medio de extracción o Buffer de separación, se desmenuza con

las tijeras con 2 a 3 veces el Buffer de separación.

2. Se vierte el contenido del vaso en una licuadora y se licúa. Pasar a los tubos y

centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos, retirar el sobrenadante y guardarlo.

3. A la fracción obtenida, se le agrega buffer en proporción 1:4 (colocar 4 veces el

volumen de la fracción obtenida de buffer) y se procede hacer las observaciones.

B. Aplicar el mismo procedimiento para vegetales.

VII. DISCUSION DE RESULTADOS

El fraccionamiento subcelular como herramienta para el estudio de la estructura, la composición y la funcionalidad de los distintos organelos, vesículas

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