Analisis Cafeteria

Práctica 8: CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS.

Análisis y Resultados

Muestra: E. coli

11:35 empezaron las diluciones para la cámara de Neubauer.

10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

0123

Muestra problema. 1 x 10^-1. 1 x 10^-2 1 x 10^-3

10 ml

1 x 10^-9

9

La muestra se diluyó tomando 1 ml de tubo 0 y diluyéndolo en el tubo 1 con 9 ml de solución salina al 0.9%, después se tomó 1 ml de la dilución del tubo 1 y se diluyo en 9 ml en el tubo 2, así consecutivamente hasta llegar al tubo 9. Las muestras que se leerán en la cámara de Neubauer serán las del tubo 4 (dilución 1x10^-4) y la del tubo 9 (dilución 1x10^-9).

Para observar las diluciones en la cámara de Neubauer, en un portaobjetos, se coloca una gota de la dilución que se quiere ver y se mezcla con una gota de safranina para teñir los microorganismos. Para homogenizar la gota, se usa una micropipeta que revolverá el colorante y la muestra con ayuda de la punta. Se tiene que evitar el crear burbujas en la gota muestra. Una vez que esta homogenizada la muestra, se colocará un cubreobjetos encima de la cuadricula de la cámara y se colocara la gota poco a poco, para que por capilaridad, la gota se extienda por debajo del cubreobjetos. Es importante mezclar bien la gota en la punta de la micropipeta ya que si no se homogeniza, al extender la muestra por capilaridad, primero subirá el medio y después los microorganismos, por lo que no habrá una correcta homogenización en la cuadricula de la cámara y no se podrá contar correctamente.

12:20 Se observaron las muestras.

Al observar las muestras del tubo 4 y 9, se pudo ver que no había microorganismos por lo que la muestra estaba demasiado diluida por lo que nos pasamos a observar la muestra del tubo 2. En el tubo 2 encontramos muy pocos microorganismos por lo que decidimos hacer conteo de la muestra sin dilución.

1:05 se observó la muestra sin dilución.

Se iba a hacer por triplicado el conteo de la cámara pero por falta de tiempo sólo se pudo hacer una vez. Este fue el resultado.

Para saber si se homogenizó correctamente la muestra en la cámara de Neubauer, la cantidad de microorganismos contados por cuadro debe de variar por + 1.

1

2

1

2

2

2

0

1

1

0

1

1

1

2

2

2

2

1

0

1

2

1

1

1

0

Figura 1: Cuadricula cámara de Neubauer.

Como en esta práctica estamos cuantificando microorganismos, para la cámara de Neubauer sólo se utilizaron los objetivos 10x y 40x. En el de 10x sólo se localizó la cuadricula 5x5 cuadrantes. En el objetivo 40x se vio más de cerca la cuadricula 5x5 y la cuadricula interna de cada cuadro de 4x4. En ambos objetivos se observaron los microorganismos teñidos de rosa. Los resultados de los microorganismos se muestran en la Figura 1. Los microorganismos observados tenían forma de cocos. Se hizo el cálculo de la siguiente manera:

Concentración = 30 x 10.000 / 25 = 12000 # de microorganismos / ml.

En la cuantificación de microorganismos por este método si te da por encima de 2.5x10^6 #micro /ml aumenta la posibilidad de cometer errores de conteo por lo que se recomienda diluir la muestra pero en este caso nos dio por debajo de 250 000 #micro/ml, cantidad de células insuficiente para dar una estimación confiable.

1:10 Se midieron las absorbancias con el espectrofotómetro. Parámetros para una buena cuantificación por turbidimetría:

1. Se obtiene una curva tipo de un número de microorganismos conocido y una absorbancia conocida. La grafica tiene que dar una línea recta en forma ascendente. Con esta curva tipo obtengo el número de microorganismos de mi muestra.

2. El coeficiente de relación entre variables (R2) tiene que ser >0.99 ya que si el valor da menos significa que no hay suficiente relación entre las variables como para confiar en los datos obtenidos.

3. La desviación estándar tiene que ser >90% del promedio de las absorbancias.



4. La absorbancia no debería de dar >1 porque es el –log de la transmitancia (cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en la unidad de tiempo). Si llega a dar >1 se diluye la muestra en la celda y se coloca 50% de muestra y 50% del diluyente. Para quitar el factor de dilución de la muestra, se saca el número de microorganismos en esa absorbancia y después se multiplica por la dilución. (Ej. Si se diluyó la muestra a la mitad, se saca el número de microorganismos y eso se multiplica por dos). No se multiplica la absorbancia por la dilución porque no estamos midiendo absorbancias sino número de microorganismos.

5. Para obtener el número de microorganismos se usa la ecuación de la recta obtenida de los datos de la absorbancia, en donde “y” seria la absorbancia

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