Analisis de hidropatia

A

ANALISIS DE HIDROPATIA

Identifica las porciones de la cadena polipeptidica que son propensas a acoplarse a la proteina globular o a exponerse en su superficie, detectando los segmentos transmembrana potenciales.

La identificacion de regiones expuestas en las proteinas es particularmente importante porque permite caracterizar la presencia de dominios con picos hidrofílicos que podrían ser sitios potencialmente antigénicos . Los metodos clasicos de analisis hidropatico grafican la hidropatia a lo largo de la secuencia, usando una ventana corrediza y tablas hidropaticas de amino acidos. El PHD (neural network program), en adicion a la prediccion de la estructura secundaria, tambien predice los segmentos de la proteina que se encuentran expuestos y acoplados.

ANTICUERPO

Los anticuerpos (también conocidos como inmunoglobulinas, abreviado Ig), son glicoproteínas del tipo gamma globulina. Pueden encontrarse de forma soluble en la sangre u otros fluidos corporales de los vertebrado o plantas, disponiendo de una forma idéntica que actúa como receptor de los linfocitos B y son empleados por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos extraños tales como bacterias,virus o parásitos.

El anticuerpo típico está constituido por unidades estructurales básicas, cada una de ellas con dos grandes cadenas pesadas y dos cadenas ligeras de menor tamaño, que forman, por ejemplo, monómeros con una unidad, dímeros con dos unidades o pentámeros con cinco unidades. Los anticuerpos son sintetizados por un tipo de leucocito denominado linfocito B. Existen distintas modalidades de anticuerpo, isotipos, basadas en la forma de cadena pesada que posean. Se conocen cinco clases diferentes de isotipos en mamíferos que desempeñan funciones diferentes, contribuyendo a dirigir la respuesta inmune adecuada para cada distinto tipo de cuerpo extraño que encuentran.

Activación del complemento

Los anticuerpos que se unen a la superficie de los antígenos, por ejemplo, en una bacteria, atraen los primeros componentes de la cascada del complemento mediante su región Fc e inician la activación del sistema "clásico" del complemento. Esto acaba con la muerte de la bacteria de dos formas: Primero, la unión de las moléculas del complemento con el anticuerpo marca al agente extrano para la ingestión por los fagocitos en un proceso llamado opsonización. Estos fagocitos son atraídos por ciertas moléculas del complemento. En segundo lugar, algunos componentes del sistema del complemento forman un complejo de ataque a membrana para ayudar a los anticuerpos a matar a la bacteria por medio de lisis. Los anticuerpos más efectivos en la activación del Sistema del Complemento son los de tipo IgM y los de tipo IgG subclase 1 y 3 (IgG1 e IgG3)

USOS DE LOS ANTICUERPOS

Especificidad de unión, Homogeneidad, Capacidad para ser producidos en cantidades ilimitadas.

Los Ac monoclonales son una valuable herramienta de investigación, p.e. un Ac monoclonal que interactúa con una proteína puede usarse para marcar y así localizará esta proteína en una célula específica de un órgano o dentro de la célula en un compartimiento subcelular específico. Una vez identificadas aún las proteínas pueden ser aisladas por columnas de afinidad a las que se unen los Ac monoclonales.

Un Ac monoclonal se puede considerar como un reactivo químico bien definido que puede reproducirse a voluntad en contraste con un antisuero convencional, que es una mezcla variable de especies químicas y nunca se puede reproducir cuando se agota el material original.

La ventaja más importante de la técnica de hibridomas es que se pueden hacer Ac monoclonales contra moléculas no purificadas que constituyen un componente menor de una mezcla compleja. Esta ventaja deriva del hecho que se pueden seleccionar clones de hibridomas individuales que produzcan un Ac en particular en una gran mezcla de células híbridas diferentes que producen una variedad de Ac diferentes.

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ATP

El trifosfato de adenosina o adenosín trifosfato (ATP, del inglés Adenosine TriPhosphate) es un nucleótido fundamental en la obtención de energía celular. Está formado por una base nitrogenada (adenina) unida al carbono 1 de un azúcar de tipo pentosa, la ribosa, que en su carbono 5 tiene enlazados tres grupos fosfato.

Se produce durante la fotorrespiración y la respiración celular, y es consumido por muchas enzimas en la catálisis de numerosos procesos químicos. Su fórmula es C10H16N5O13P3.

Las reacciones endergónicas se manifiestan durante los procesos anabólicos que requieren energía para convertir los reactivos(sustratos o combustibles metabólicos) en productos. Por otro lado, durante las reacciones exergónicas se libera energía como resultado de los procesos químicos (ejemplo: el catabolismo de macromoléculas). La energía libre en un estado organizado, disponible para trabajo biológico útil. Las reacciones endergónicas se llevan a cabo con la energía liberada por las reacciones exergónicas. Las reacciones exergónicas pueden estar acopladas con reacciones endergónicas. Reacciones de oxidación-reducción (redox) son ejemplos de reacciones exergónicas y endergónicas acopladas.

Los organismos pluricelulares del Reino Animal se alimentan principalmente de metabolitos complejos (proteínas, lípidos, glúcidos) que se degradan a lo largo del tracto intestinal, de modo que a las células llegan metabolitos menos complejos que los ingeridos, por ejemplo vía la oxidación a través de reacciones químicas degradativas (catabolismo). Los metabolitos simples y la energía obtenida en este proceso (retenida en su mayoría en el ATP) conforman los elementos precursores para la síntesis de los componentes celulares. A todo el conjunto de reacciones de síntesis se llama anabolismo.

Además, en el catabolismo (oxidación) se produce una liberación de electrones que son captados por moléculas transportadoras de electrones como el NAD+ (que al aceptar electrones se reduce a NADH).

Recapitulando, la síntesis (anabolismo) de los compuestos celulares se realiza con los metabolitos simples, utilizando la energía contenida en el ATP y los electrones contenidos en el NAD, siendo un proceso reductivo (reducción de electrones). Podría decirse que el ATP es la moneda de intercambio energético debido a su estructura química. Cuando se hidroliza libera mucha energía que es captada por las enzimas que catalizan las reacciones de biosíntesis.

azul de Coomassie

AZUL DE COOMASSIE

También llamado Coomassie blue o Coomassie Brilliant blue es un colorante derivado del trifenilmetano. Originalmente se utilizó en la industria textil, pero actualmente es muy empleado en bioquímica para teñir geles de electroforesis y en la cuantificación de proteína por el método de Bradford.

El nombre de Coomassie se aprobó a finales del siglo 19 como un nombre comercial por el fabricante del tinte Blackley Ltd Levinstein. En 1896, durante la Cuarta Guerra Anglo-Ashanti, las fuerzas británicas tenían ocuparon el pueblo de Coomassie (hoy en día en Kumasi, en Ghana). En 1918 Levinstein Ltd pasó a formar parte de British Dyestuffs que en 1926 pasó a formar parte de la Imperial Chemical Industries. A pesar de que ICI todavía posee la marca de Coomassie, la compañía ya no fabrica los tintes.

Artículos publicados en revistas de bioquímica con frecuencia se refieren a estos colorantes simplemente como "Coomassie" sin especificar a qué medio de contrastese utiliza realmente. De hecho, el Índice de Color enumera más de 40 colorantes con "Coomassie" en su nombre.

Formula molecular: C47H49N3NaO7S2

Masa molar: 825,97 g/mol

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B

BamHI

BamHI: Es una enzima de restricción , derivada de Bacillus amyloliquefaciens. Utilizada junto con primers para la amplificación del ADN que luego se utilizara para clonación. BamHI, tiene el sitio de reconocimiento en 5'GGATCC y 3'CCTAGG, dejando un extremo pegajoso, compatible con muchas otras enzimas. Es recomendable utilizar alícuotas antes de su uso, por algun problema con el procedimeinto. En la ingeniería se han creado variantes de de la enzima con el fin de evitar la actividad estrella .

Bioreactor

BIOREACTOR

After having cloned the gene of interest and having optimised the conditions to induce the expression of the target protein, one has to consider producing it on a large scale. If any protein encoding gene is expressed in a heterologous host, is called a recombinant protein. The cells harbouring cloned genes of interest may be grown on a small scale in the laboratory. The cultures may be used for extracting the desired protein and then purifying it by using different separation techniques.Small volume cultures cannot yield appreciable quantities of products. To produce in large quantities, the development of bioreactors, where large volumes (100-1000 litres) of culture can be processed, was required.

Bioreactors can be thought of as vessels in which raw materials are biologically converted into specific products, individual enzymes, etc., using microbial plant, animal or human cells. A bioreactor provides the optimal conditions for achieving the desired product by providing optimum growth conditions (temperature, pH, substrate, salts, vitamins, oxygen).

A stirred-tank reactor is usually cylindrical or with a curved base to facilitate the mixing of the reactor contents.

The stirrer facilitates even mixing and oxygen availability throughout the bioreactor. Alternatively

air can be bubbled through the reactor. The bioreactor has an agitator system, an oxygen delivery

system and a foam control system, a temperature control system, pH control system and sampling ports so that

small volumes of the culture can be withdrawn periodically

BL21

La cepa de Escherichia coli más utilizada en los sistemas de expresión es la BL21, debido a que es defectiva en las proteasas OmpT y Lon, involucradas en la degradación de proteínas. En función del sistema de expresión empleado, la cepa puede contener el módulo regulador de la expresión integrado en el cromosoma. En el caso concreto de los sistemas de expresión pET (Novagen) y pRSET (Invitrogen) la cepa de expresión contiene el ADN del bacteriófago DE3 integrado en el cromosoma. Este bateriófago contiene a su vez el gen codificante de la T7 RNA polimerasa regulado por el promotor lacUV5 cuya actividad se induce por medio de la adición del inductor IPTG (Isopropyl-?-D-thiogalactopyranoside). En este sistema, el vector de expresión pET utilizado para la expresión de la secuencia codificante de la proteína de interés, incorpora una región promotora reconocida por la T7 RNA polimerasa, de manera que tras la adición del IPTG, la T7 RNA polimerasa expresada desde el cromosoma bacteriano induce la expresión de la proteína a partir del vector. En el caso de los sistemas pGEX (GE Healthcare), pQE (QIAGEN), pTrc (Invitrogen), pBAD (Invitrogen) la expresión de las proteínas recombinantes no está supeditada a la presencia de un módulo regulador integrado en el cromosoma de la bacteria. En estos casos, los elementos reguladores del promotor para la expresión de proteínas recombinantes están incluidos en el vector, por lo que el mismo vector puede emplearse en combinación con diferentes cepas.

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C

cDNA Library

cDNA Library (Biblioteca de ADN complementario): Una biblioteca genómica contiene secuencias que se transcriben y secuencias que no se transcriben, mientras que una biblioteca de cDNA (DNA complementario) contiene solo secuencias que se transcriben y que no son eliminadas durante el procesamiento del RNA. Es una combinación de fragmentos de cDNA clonados, insertados dentro de una colección de células hospedadoras, los cuales juntos constituyen alguna porción del transcriptoma del organismo. cDNA se produce de la transcripción completa del mRNA encontrado en el núcleo y por lo tanto contiene solo los genes que se expresan de un organismo; con base en este mRNA, se produce cDNA utilizando transcriptasa inversa la cual produce DNA de una banda que va a convertirse en DNA de dos bandas con la enzima DNA polimerasa I de E. coli y este DNA se somete en forma adecuada a la reacción de transferencia terminal y luego, el DNA resultante se clona. Aunque la información en una biblioteca de cDNA es una poderosa y útil herramienta debido a que los productos de los genes son fácilmente identificables, les falta información acerca de enhancers, introns y otros elementos regulatorios encontrados en una librería genómica.

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Chaperonas

Las chaperonas se caracterizan por tener representantes en todos los compartimentos celulares, en los cuales se unen a una amplia gama de proteínas, formando parte del mecanismo general que determina su plegamiento. Podemos establecer dos tipos distintos de chaperonas: Las chaperonas moleculares y las chaperoninas. Las primeras se encargan de estabilizar a aquellas proteínas que no están plegadas, impidiendo así su degradación. Las segundas facilitan el plegamiento de las cadenas polipeptídicas.

Chaperoninas eucariotas, o TciP, son grandes complejos formados por ocho unidades de Hsp60. En las células del tipo procariota las chaperoninas poseen catorce sub unidades idénticas que conforman un complejo con forma de barril, conocido bajo las siglas GroEL.

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chaperonin

CHAPERONA

Las proteínas chaperonas son un conjunto de proteínas presentes en todas las células, muchas de las cuales son proteínas de choque térmico, cuya función es la de ayudar al plegamiento de otras proteínas recién formadas en la síntesis de proteínas. Estas chaperonas no forman parte de la estructura primaria de la proteína funcional, sino que sólo se unen a ella para ayudar en su plegamiento, ensamblaje y transporte celular a otra parte de la célula donde la proteína realiza su función. Los cambios de conformación tridimensional de las proteínas pueden estar afectados por un conjunto de varias chaperonas que trabajan coordinadas, dependiendo de su propia estructura y de la disponibilidad de las chaperonas.

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Chaperoninas (Cpns)

Son proteínas que ayudan al plegamiento y desplegamiento de otras proteínas. Las proteínas nuevas (sintetizadas) normalmente deben cambiar de su conformación linear de aminoácidos plegándose en su forma tridimensional, la energía para el plegamiento proviene de la hidrólisis del ATP. Las chaperoninas pertenecen a una clase de moléculas llamadas chaperonas moleculares que asisten el plegamiento proteico. Están divididas en 2 subgrupos:

Grupo I (Familia GroEL) se encuetran en eubacteria, mitocondrias y cloroplastos.

Grupo II (familia TriC) se encuentran en el citosol eucariota y en archeobacterias, de este grupo, sólo las Cpns de archeobacterias son inducibles por choque de calor.

La Cpns 60 de Escherichia coli (GroEL) es mejor caracterizada, su mecanismo de acción es aun objeto de investigación. Sólo hasta estudiar los detalles moleculares de la participación de las GroEL en el plegamiento proteico, fue claro que la Cpn60 y las chaperonas en general tienen un papel adicional como moléculas de señalización intercelular.

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Clonación Molecular

Es una técnica molecular ampliamente utilizada en la construcción de bibliotecas de ácidos desoxiribonuclicos complementarios (cDNA) y producción de proteínas de fusión (ensambladas) entre muchos otros usos mas.

Básicamente la técnica pretende obtener muchas copias de un fragmento de ADN en particular y para llevar a cabo la clonación molecular se siguen 7 pasos fundamentales (para una proteína de interes, puesto que dependiendo del fragmento de ADN que se necesite clonar se pueden modificar y/o omitir o añadir algunos pasos extras):

1) Aislamiento de ARN

2) RT-PCR (Transcripción Inversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa)

3) Ligación al vector

4) Transformación del sistema de expresión

5) Detección de clones recombinantes

6) Inducción y expresión

7) Purificación

1) Aislamiento de ARN: Se extrae el ARN que se desee utilizar (dependiendo de la investigación) por métodos de digestión artificial, posteriormente para la extracción del ARN, se expone el digerido a sustancias desnaturalizantes como el Tiocianato de Guanidina; Aunque se pueden utilizar también soluciones comerciales para extracción y desnaturalización de ARN.

2) RT-PCR: Se utiliza como molde el fragmento de ARN extraido para obtener el cDNA que codifica para la proteína en la que estemos interesados. Para ello se emplea la enzima transcriptasa-inversa (retrotranscripción RT) que reconoce como sustrato al ARN, esta incorpora los dNTPs correspondientes para la formación del cDNA por la via de la cola de poli-adenina del RNA mensajero. Posteriormente se realiza PCR con primers especificos y un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción, para amplificar solamente el sector codificado por la proteína.

3) Ligación del vector: Se selecciona un vector de transformación dependiendo de los requerimientos. Pero en general se utilizan vectores comerciales que estan disponibles para diversos tipos de transformación.

Las características primordiales que deberian presentar los vectores plasmídicos para transformación de bacterias son:

Poseer una región promotora, una región de reconocimiento al ribosoma (RBS), un sitio de reconocimiento múltiple a varias enzimas de restricción,una región tag que permita la purificación de la proteína de fusión en un unico paso, un gen de resistencia a antibióticos para seleccionar los clones recombinante.

Para la ligación al vector en primer lugar se somete el vector a la acción de las mismas enzimas

de restricción, en concordancia a los sitios agregados a los productos de PCR por la acción de los

cebadores. De esta manera el vector abierto se incuba en presencia de una enzima ligasa (p.ej. T4) con la

proporción adecuada de ADNc productos de la PCR.

4) Transformación del sistema de expresión: Es el proceso mediante el cual se construye el fragmento recombinante (vector + inserto) dentro del sistema de expresión elegido y se incuba el cultivo bacteriano para su posterior selección de clones recombinantes.

5) Detección de clones recombinantes: La selección de clones transformantes se puede hacer de varios modos distintos. Pero por ejemplo, sí se ha empleado la bacteria E. coli como sistema de expresión, una de las formas de selección de transformantes mas utilizada es el cultivo de las mismas en presencia del antibiótico de selección (cuyo gen se encuentra incluído en el vector). Aquellas colonias que sean capaces de crecer en presencia del medio con antibiótico son las que incorporaron exitosamente el vector durante el proceso de transformación.

Dichas colonias transformadas pueden ser sometidas a una reacción de PCR para verificar la

presencia del inserto dentro del vector

6) Inducción y expresión: Para obtener las proteínas recombinantes es necesario multiplicar la biomasa del sistema de expresión y luego inducir mediante el agregado de un agente inductor de la expresión de las proteínas. El proceso de inducción, debe evidenciarse probando la concentración de la proteína en diferentes tiempos de producción.

7) Purificación: La purificación de la proteína puede realizarse con la forma nativa o desnaturalizada.

Las proteínas que se encuentren en forma insoluble dentro de cuerpos de inclusión, pueden

recuperarse por solubilización con agentes caotrópicos (por ejemplo urea) y posteriormente ser rena-

turalizadas.

Cloroplasto

o El cloroplasto es un miembro especializado de una familia de orgánulos vegetales denominados plástidos; los cloroplastos contienen el pigmento verde: clorofila, junto con enzimas y otras moléculas que cumplen la función de producir hidratos de carbono mediante la fotosíntesis. Estos orgánulos con forma de lentes, que miden cerca de 2 µm por 5 µm, se encuentran en las hojas y en otros órganos verdes de las plantas y en las algas.

o Los cloroplastos son organelos citoplasmáticos exclusivos de las células vegetales, varían en forma, tamaño y número de unas células a otras; poseen una estructura tan complicada como la de la mitocondria; un cloroplasto presenta dos membrana: una externa que lo delimita y otra interna que se repliega hacia el interior, en donde existe un tercer conjunto de membranas que forman cavidades aplanadas llamadas tilacoides.

o El sitio de la fotosíntesis en los eucariontes es el cloroplasto, un miembro de los orgánulos subcelulares membranosos propios de las plantas conocidos como plástidos. Los cloroplastos deben ser el sitio de generación de oxígeno impulsado por la luz; los cloroplastos de los cuales hay de 1 a 1000 por célula, por lo general son elipsoides largos; su membrana interna encierra la estroma, una solución concentrada de enzimas muy similar a la matriz mitocondrial, que también contiene el DNA, RNA y los ribosomas que participan en la síntesis de varias proteínas del cloroplasto. La estroma, a su vez, rodea un tercer compartimiento membranoso, el tilacoide; es probable que éste sea una vesícula muy plegada, aunque en la mayoría de los organismos parece consistir en apilamientos de sacos con forma de disco llamados granas, que están interconectados por una estroma laminar no empaliada. Un cloroplasto usualmente contiene de 10 a 100 granas. Las membranas del tilacoide surgen de invaginaciones de la membrana interna de los cloroplastos en desarrollo, asemejándose a las crestas mitocondriales.

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Co-inmunoprecipitación

Co-inmunoprecipitación (IP-Co) es una extensión de inmunoprecipitación (IP) que se basa en el potencial de reacciones IP para capturar y purificar el antígeno, así como detectar e identificar interacciones proteína-proteína mediante el uso de un anticuerpo específico en la solución de muestra. Por lo tanto, en un experimento con una dirección IP o IP-Co, se debe tener en cuenta si el objetivo del experimento es el objetivo principal, es decir, el antígeno o los objetivos secundarios, los cuales serían las proteínas que interactúan.

Estos complejos de proteínas pueden ser analizados para identificar nuevas parejas de unión, afinidades de unión, la cinética de unión y la función de la proteína diana.

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Complejo proteico de canal de conducción (protein conducting channel PCC)

Muchas proteínas hidrofilicas, solubles y la mayoría de las proteínas de membrana deben integrarse en la membrana citoplasmática en procariotas o en el retículo endoplasmático (ER) de la membrana de eucariotas, desde allí, están ordenados por diversos mecanismos para su cumplir su función.

Para sobrepasar la barrera energética de la bicapa lipídica,las proteínas atraviesan membranas celulares a través de un complejo proteico que también recibe el nombre de 'Translocon' o 'translocasa'. En el centro de la translocasa se encuentra la proteína del canal de conducción, que consiste en un complejo de proteínas oligoméricas de una membrana integral heterotrimérica, SecYEG en eubacterias y Sec61αβγ en eucariotas.

A medida que el PCC no usa nucleótidos para generar energía, se debe asociar con los componentes celulares que proporcionan la fuerza motriz necesaria para la translocación del polipéptido o la inserción. La translocasa puede participar en dos tipos de procesos: cotranslacional y post-translacional/translocación. Los polipéptidos que todavía están en el proceso de traducción (polipéptidos nacientes) son translocados por la translocasa mientras que el ribosoma está unido a la PCC.

La energía para la translocación proviene de la hidrólisis de GTP en el ribosoma durante la elongación del polipéptido. Durante la translocación post-traduccional, un polípeptido totalmente traducido, pero sólo parcialmente doblado (preproteína), es transportado a través de la translocasa con la ayuda de factores solubles que usan energía. SecA en eubacteria6 y BIP en eucariotas.

Además de la translocación direccional del polipéptido con uso intensivo de energía del, también se requiere la capacidad de la PCC para interactuar de forma dinámica con las demás moléculas de unión y el polipéptido naciente. La PCC debe ser capaz de mediar tanto la translocación de las regiones hidrófilas de polipéptidos a través de un canal acuoso corriendo perpendicularmente al plano de la membrana y la integración de transmembranal de hélices hidrofóbicas (TMHS) mediante el control de su partición lateral en el plano de la bicapa lipídica.

Un número creciente de estudios bioquímicos, genéticos y biofísicos afirma la versatilidad de la PCC, tanto en términos de la variedad de componentes citosólicos y de membrana que esta une y los efectos que la PCC tiene en estas parejas de unión.

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Coprecipitated/ coprecipitado

Es el proceso mediante el cual una sustancia, que en condiciones normales es soluble,es acarreada junto al precipitado deseado.

Para el caso del articulo, la proteina coprecipitada es la stromal chaperonin 60 (cpn 60).

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D

Desnaturalización

La desnaturalización es un cambio en la estructura nativa de proteínas y ácidos nucleicos, causando la alteración del funcionamiento y también cambios en sus propiedades físico-químicas.

Desnaturalización de una proteína

La mayoría de las proteínas pierden su función biológica cuando están desnaturalizadas, por ejemplo, las enzimas pierden su actividad catalítica, porque los sustratos no pueden unirse más al centro activo, y porque los residuos del aminoácido implicados en la estabilización de los sustratos no están posicionados para hacerlo.

Esta alteración de debe a factores externos conocidos como agentes desnaturalizantes, que pueden ser físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica)..

Efectos de la desnaturalización en proteínas:

-En la estructura cuaternaria las subunidades de proteínas se separan o su posición espacial se corrompen.

-A nivel de la estructura terciaria se da la interrupción de:

.Enlaces covalentes entre las cadenas laterales de los aminoácidos (como los puentes disulfuros entre las Cisteínas).

.Enlaces no covalentes dipolo-dipolo entre cadenas laterales polares de aminoácidos.

.Enlaces dipolo inducidos por fuerzas de Van Der Waals entre cadenas laterales no polares de aminoácidos

-A nivel de la estructura secundaria se pierden los patrones de repetición regulares como las hélices alfa adoptando formas aleatorias.

-La estructura primaria no es interrumpida por la desnaturalización

.

Reversibilidad e irreversibilidad

Dependiendo del grado de modificación de las estructuras de la proteína, la desnaturalización puede o no ser reversible. Se ha podido revertir procesos de desnaturalización quitando el agente desnaturalizante, en un proceso que puede tardar varias horas, incluso días; esto se debe a que el proceso de reestructuración de la proteína es tentativo, es decir, no asume su forma original inmediatamente, así muchas veces se obtienen proteínas distintas a la inicial, además con otras características como insolubilidad (debido a los agregados polares que puedan unírsele). Recientemente se ha descubierto que, para una correcta renaturalización, es necesario agregar trazas del agente desnaturalizante. Esto fue importante históricamente, porque condujo a la noción de que toda la información necesaria para que la proteína adopte su forma nativa se encuentra en la estructura primaria de la proteína, y por lo tanto en el ADN que la codifica.

Desnaturalización de ácidos nucleicos

La desnaturalización de ácidos nucleicos como el ADN por altas temperaturas produce una separación de la doble hélice, que ocurre porque los enlaces o puentes de hidrógeno se rompen. Esto puede ocurrir durante la reacción en cadena de la polimerasa; las cadenas del ácido nucleico vuelven a unirse (renaturalizarse) una vez que las condiciones "normales" se restauran. Si las condiciones son restauradas rápidamente, las cadenas pueden no alinearse correctamente.

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E

EDTA

El ácido etilendiaminotetraacético o EDTA, es una sustancia utilizada como agente quelante que puede crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinación octaédrica. Coordina a metales pesados de forma reversible por cuatro posiciones acetato y dos amino, lo que lo convierte en un ligando hexadentado, y el más importante de los ligandos quelatos.

EDTA, tiene cuatro carboxilo y dos grupos amino; grupos que pueden actuar como donantes de pares electrones, o bases de Lewis. La capacidad de EDTA para potencialmente donar sus seis pares de electrones para la formación de enlaces covalentes coordinados a cationes metálicos hace al EDTA un ligando hexadentado. Sin embargo, en la práctica EDTA suele estar parcialmente ionizado, y, por tanto, formar menos de seis enlaces covalentes coordinados con cationes metálicos. El Disodio EDTA se utiliza comúnmente para estandarizar las soluciones acuosas de cationes de metales de transición.

EDTA forma un complejo octaédrico con la mayoría de cationes metálicos 2+, M2+, en solución acuosa. La razón principal de que el EDTA se utiliza de manera amplia en la normalización de los cationes metálicos de soluciones es que la constante de formación para la mayoría de complejos cationes metálicos con EDTA es muy alta, lo que significa que el equilibrio de la reacción:

M2+ + H4Y → MH2Y + 2H+

se encuentra ahora a la derecha. Llevar a cabo la reacción en una solución tampón básico elimina H+ , cuando este se forma, lo que también favorece la formación de los complejos de EDTA con cationes metalicos como producto de la reacción. Para la mayoría de los propósitos se puede considerar que la formación de los complejos EDTA con cationes metálicos es completa, y esta es la principal razón por el cual el EDTA se utiliza en valoraciones/estandarizaciones de este tipo.

El EDTA y sus sales sódicas derivadas se utilizan para precipitar metales pesados tóxicos de manera que puedan ser excretados por la orina. La fijación de plomo, cadmio, níquel por el EDTA, muestra una relación favorable en el cuerpo humano, sin embargo, la unión a cobre, hierro y cobalto no es tan fuerte. El EDTA quela óptimamente dentro de un estrecho margen de pH, dentro del cual están el pH de la sangre y de los líquidos tisulares. Para ser útil, el EDTA y cualquier agente quelante, deben tener un grado de pH de óptima actividad fijadora para cada metal.

F

Filtro de nitrocelulosa

Un filtro de nitrocelulosa consta de una malla cerrada de fibras de nitrocelulosa. El metodo de fabricacion permite el contro del tamaño maximo de las particulas que vayan a pasar a través del filtros. Los poros de los filtros de nitrocelulosa no son circulares, sino que tienen forma irregular y ocupan aproximadamente el 80% de la superficie. Los filtros no son lo suficientemente finos como para que las particulas que no los atraviesen no penetren en el filtro, sino que queden en la superficie. En consecuencia, las partículas pueden ser lavadas con facilidad en la superficie. La nitrocelulosa es hodrifóbica, de modo que para humedecer los filtros, muchos contienen un detergente o un agente tensoactivo, cuya identidad no es revelada por los fabricantes. Los filtros son muy quebradizos cuando están secos, por lo que muchos de ellos contienen pequeñas cantidades de glicerol para aumentar su flexibilidad.

Fluorografía

Es una tecnica usada para visualizar materiales radioactivos en una muestra; consiste en cubrir la muestra con fluor sólido, permitiendo que los fotones expulsados oscurescan una emulsión aplicada fotográfica.

Palabra(s) clave:

G

GroEL TRAP

Versión modificada de las chaperoninas que intervienen en la eficiencia de plegado de muchos polipéptidos recién sintetizados en el citosol bacteriano, GroEL es un complejo de proteínas cilíndrico de 14 subunidades de 57 kDa que están dispuestas en dos anillos apilados.

El sustrato de ésta versión se une en la cavidad central del cilindro en la conformación todavía inestable, ésta reacción no es dependiente de ATP. Ésta modificación de las chaperoninas GroEL puede ser usada como "trampa" para determinar si algunas proteinas están o no plegadas luego de un evento desnaturalizante como por ejemplo el empleado en un inmunoblot.

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H

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Las interacciones necesarias para el apareamiento de bases complementarias constituyen el fundamento de la hibridación molecular, el cual es uno de los experimentos más informativos en cuanto a las técnicas utilizadas en la biología molecular.

La hibridación molecular consiste en el empleo de sondas de ADN o ARN marcadas que son específicas para otras secuencias de ADN o ARN. De un modo más amplio, la hibridación es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Dos tipos básicos de hibridación son posibles:

- Hibridación de Southern

- Hibridación de Northern

Las sondas son la principal herramienta usada para identificar las secuencias complementarias de interés. Generalmente, la sonda es un clon desarrollado mediante la inserción de ADN en un vector.

En el artículo para escrutar una genoteca de ADNc Agtll utilizaron hibridación acuosa estándar como técnica molecular.

Hsp70

Las Hsp70 son proteínas de choque térmico presentes en todos los organismos. Estan implicadas en el plegamiento de proteínas y, por lo tanto, en su estructura. Son necesarias para el desarrollo de la fisiología celular. Son especialmente abundantes en respuesta al estrés térmico y de otros tipos. Su función es de chaperona molecular, estabilizando proteínas en estados de plegamiento parcial, como por ejemplo durante el transporte a través de la membrana. Los genes codificantes de miembros de la familia de proteínas se sobreexpresan durante el estrés térmico o en presencia de tóxicos como el arsénico, cadmio, mercurio o cobre. Las Hsp70 fueron descubiertas por Ritossa mediante un análisis de estructura del ADN: debido a la alta transcripción de las zonas que contienen estos genes, la cromatina se encuentra especialmente laxa donde estos se localizan.Esto fue más tarde descrito como Respuesta a Estrés Térmico ("Heat Shock Response") y se denominó a las proteinas como "Heat Shock Proteins" (Hsps).

Las proteínas Hsp70 poseen tres dominios funcionales:

* Un dominio ATPasa en su N terminal. Une ATP y lo hidroliza al ADP y fósforo inorgánico. Esta funciòn modifica la conformación de sus otros dos dominios.

* Dominio de union al sustrato. Contiene aminoácidos neutros e hidrofóbicos para interactuar con las cadenas peptídicas de otras proteínas de hasta 7 residuos de longitud.

* Un dominio C-terminal en alfa hélice, que funciona como tapa para el dominio de unión al sustrato; en presencia de ATP, la tapa está en una posición tal que permite la unión y liberación de los péptidos con facilidad, mientras que cuando esta presente el ADP la conformación es distinta, cerrando el hueco de unión y atrapando al péptido en cuestión.

Palabra(s) clave:

I

IAPs (import intermediate associated proteins)

La importación de proteínas a través de la envoltura del cloroplasto se puede dividir en dos pasos:

1. La unión específica del precursor citosólico con la envoltura externa del cloroplasto con hidrólisis de ATP y GTP, la cual está mediada por la secuencia de tránsito amino-terminal de la proteína precursora.

2. Translocación del polipéptido precursor a través de la doble membrana hacia el estroma. La translocación requiere la hidrólisis de ATP en el compartimiento del estroma. La translocación se localiza en zonas de contacto entre la membrana externa e interna, facilitando así el transporte simultáneo de polipéptidos a través de las dos membranas.

Un subconjunto específico de proteínas de membrana externa forma un complejo estable con intermedios de importación temprana. Las proteínas son IAP34 y IAP86 las cuales están firmemente ancladas en la membrana externa con sus dominios N-terminalout, C-terminalin, donde el dominio N-terminalout está expuesto al citosol y se une con el GTP.

IAP75 funciona como un canal proteico conductor o poro de translocación de intermediarios.

IAP100 and IAP36 están asociadas con la importación de intermediarios tardía al interior de la membrana. IAP36 es una proteína integral de membrana, con dominios transmembrana α-hélice en el extremo N-terminal.

IAP21 y IAP25

Componentes adicionales de la maquinaria de importación, los cuales se entrecruza con la secuencia o péptido de tránsito en la importación temprana de intermediarios, y se localizan en la membrana interna de cloroplasto.

Aislamiento de membranas intracelulares por extracción de carbonato de sodio

Este método es útil para determinar si una proteína de membrana integral, mantiene estable su inserción en la bicapa, ya que las interacciones proteína-proteína son interrumpidas, pero la interacción lípido-proteína permanece estable. El procedimiento consiste en diluir los organelos incubados a 0 °C durante 30 minutos en 100 mM Na2CO3 a pH 11,5 seguidos por centrifugación para sedimentar las membranas. Se forman vesículas al separar las láminas de la membrana celular, las proteínas de membrana se liberan en forma soluble.

Los gránulos se disuelven en 500 mM de NaOH para las determinaciones de proteínas, o se extrae con cloroformo / metanol para los análisis de fosfolípidos, o disueltos en SDS para PAGE.

Palabra(s) clave:

IgG

Hace referencia a uno de los 5 tipos de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE), proteinas que se encuentran formando los anticuerpos en los organismos.La mayoría de los anticuerpos en la sangre y el líquido que baña los tejidos y células del cuerpo son de la clase IgG. La clase de anticuerpos IgG se encuentra compuesta por cuatro subtipos diferentes de moléculas IgG llamadas subclases IgG. Estas son designadas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Todas las subclases IgG contienen anticuerpos, cada subclase cumple diferentes funciones en la protección del cuerpo contra infecciones. Por lo tanto, la inhabilidad de producir anticuerpos de una subclase específica puede hacer que el individuo sea susceptible a ciertas clases de infecciones pero no a otras. El IgG circulante en el torrente sanguíneo es 60-70% IgG1, 20-30% IgG2, 5-8% IgG3 y 1-3% IgG.

Palabra(s) clave:

Immunoblot

Tambien llamada western blot, es una técnica usada para detectar proteínas especifícas que se encuentran en una muestra que contiene una mezcla compleja de proteínas (extracto tisular). Pasos de la técnica:

1. Realizar una electroforesis en gel (la mas frecuente es SDS-PAGE o electroforesis en gel de poliacrilamida) para separar las proteínas ya sea por su peso molecular (mas utilizada), hidrofobicidad, estructura, etc.

2. Transferencia de estas proteinas a una membrana adsorbente, principalmente membrana de nitrocelulosa, para poder buscar la proteina de interes con anticuerpos específicos contra ella

3. Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de proteínas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana.

4. Detección de la proteina, se agrega el anticuerpo primario especifico de la proteina para que este se una a la proteína y posteriormente se agrega el anticuerpo secundario (anticuerpo del anticuerpo) que debe estar marcado (actividad enzimatica clorimétrica, fluerescencia, radiactividad, etc) para poder ver la presencia o no de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas.

Palabra(s) clave:

Inmunodeficiencia

INMUNODEFICIENCIA PRIMARIA

Inmunodeficiencia primaria provoca disminución del funcionamiento del sistema inmunitario y, por lo tanto, la defensa del organismo, que es aún más susceptible a diferentes patógenos, virus, bacterias y cuerpos extraños al organismo. La causa de la enfermedad es una mutación de la información genética. Según cual función presenta daños, puede ser parte del sistema de la inmunidad específica o no específica, la inmunodeficiencia primaria está clasificada en:

o Déficit de anticuerpos

o Deficiencia celular

o Deficiencia de linfocitos B

o Deficiencia de linfocitos T

o Trastornos de la apoptosis

o Trastornos de la fagocitosis

o Deficiencia como parte de otros síndromes típicos

o Estos trastornos se pueden dar de dos maneras:

1) Congénitas -se tienen desde el nacimiento.

2) Adquiridas.

Inmunoprecipitación

Es técnica muy util cuando se asocia a electroforesisi en gel de SDS-poliacrilamida. Se puede determinar la presencia y cantidad de un antígeno, el peso molecular de una cadena polipeptidica, su síntesis y degradación y más. La técnica consiste en 6 pasos:

1) Marcaje del antígeno (opcional), 2) Preparación de las muestras: Lisis de las células para liberar el Ag, 3) Formación del complejo Ag-Ac, 4) Precipitación de los complejos Ag-Ac, 5) Purificación de los inmunocomplejos y 6) Análisis.

En la mayoría de los casos el antígeno se marca incubándolo con un precursor radioactivo aunque muchos antígenos se pueden detectar por medios que no requieren marcahe directo. El antígeno se extrae de las células mediante lisis. Después, los anticuerpos se añaden al lisado y se forman los inmunocomplejos Ag-Ac. Estos se unen por adsorción a una fase sólida que contiene proteína A.

El análisis de los inmunocomplejos generalmente se hace por electroforesis en gel.

Palabra(s) clave:

Intermediarios de translocación

Proteínas que son sintetizadas como precursores de proteína en el citoplasma y son post-traduccionalmente traslocadas en y a través de las membranas del cloroplasto (también ocurre en otros plastidios, en la mitocondria y el peroxisoma), permitiendo que la captación de proteínas avance en gran medida por la acumulación de proteínas precursoras en distintas etapas de la vía metabólica.

M

Método clásico de secuenciación

Métodos clásicos de secuenciación

Método Químico de MAXAM y GILBERT

Un fragmento de ADN se marca radiactivamente en sus extremos con gamma 32P ógamma 32S dATP por acción de la polinucleótido quinasa. La técnica consiste en romper estas moléculas marcadas con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Cuatro alícuotas de la misma muestra se tratan bajo condiciones distintas, posteriormente el tratamiento con piperidina rompe la molécula de ADN a nivel de la base modificada. Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven en función de su tamaño en geles de poliacrilamida donde la secuencia puefe leerse en base al patrón de bandas radiactivas obtenidas. Esta técnica permite la lectura de unas 100 bases de secuencia.

Palabra(s) clave:

O

OLIGOMERO

Se dice que una molécula constituye un oligómero cuando los radicales asociados son distintos entre sí. La naturaleza orgánica esta llena de estos casos multifuncionales. En cambio, un polímero es una molécula con dos o más radicales de la misma especie. Un grupo de 3 a 9 moléculas de monómero que se han unido entre sí para formar una molécula más grande. Pueden ser dímeros, tetrámeros, pentámeros, etc.

OH NCO

| |

HOOCR - R -COOH

| |

OH CHO

1,2-diol-3-ciano-3-metanal-2-dioico

Por ejemplo: la glucosa es un monómero, mientras que la sacarosa es un oligómero, un oligosacárido, concretamente undisacárido, ya que está compuesto por glucosa y fructosa, que son dos monómeros. En cambio, el glucógeno es un polímero, ya que está formado por miles de glucosas situadas ordenadamente.

o En bioquímica, el término oligómero se utiliza para el cortocircuito de los fragmentos trenzados delADN, usados generalmente en experimentos de hibridación (límite a las diapositivas de cristal o a las membranas de nylon).

o Oligómero, puede también referirse a un complejo proteico compuesto por pocas subunidades, denominado multímero. En este caso, un complejo compuesto de varias diversas subunidades de la proteína se llama un hetero-oligómero o multímero heterotípico. Cuando solamente un tipo de subunidad de la proteína se utiliza en el complejo, se llama homo-oligómero o multímero homotípico.

Palabra(s) clave:

P

PROTEÍNA INTEGRAL DE MEMBRANA

PROTEÍNA INTEGRAL DE MEMBRANA

Las proteínas integrales de membrana están embebidas dentro de la membrana plasmática mediante regiones hidrofóbicas que atraviesan la bicapa lipídica. Las partes de estas proteínas que atraviesan la membrana suelen ser regiones en hélice alfa constituídas por 20 a 25 aminoácidos hidrófobos. La formación de una alfa hélice maximiza los puentes de hidrógeno entre los enlaces peptídicos, y las cadenas laterales hidrófobas de los aminoácidos interaccionan con las colas de ácidos grasos de los fosfolípidos. La mayor parte de estas proteínas son glicoproteínas, es decir, proteínas que tienen unidos uno o varios monosacáridos. Estas proteínas integrales pueden desplazase lateralmente en la bicapa lipídica, pero son incapaces de rotar, por lo cual siempre presentan una determinada polaridad. Extraer este tipo de proteínas es muy difícil e implica la destrucción de la estructura de la membrana fosfolipídica, mediante la aplicación de detergentes iónicos fuertes como el SDS (dodecil sulfato sódico) o no iónicos como el Tritón X-100, o disolventes apolares.

R

Rubisco

La ribulosa-1,5-bisfosfato (rubisco) con actividad carboxilasa/oxigenasa cataliza el primer paso en la asimilación fotosintética de carbono a través del ciclo de Calvin y es, por tanto, la principal vía de entrada del CO2 de la atmósfera en la biosfera. La Rubisco se distribuye entre casi todos los organismos fotosintéticos incluyendo plantas superiores, algas, cianobacterias y otras bacterias fotosintéticas, encontrándose también en bacterias quimioautotróficas. En los organismos eucariotas se localiza en el estroma del cloroplasto, y en procariotas, en el citoplasma. En base a la divergencia de secuencia y a la organización oligomérica se distinguen 4 formas de la Rubisco:

Las plantas terrestres, las algas, las cianobacterias y algunas bacterias fotosintéticas poseen la forma I figura 1A, de Rubisco, donde el holoenzima es un hexadecámero compuesto por 8 subunidades grandes (L, de 51-58KDa, codificadas por el gen rbcL) y 8 subunidades pequeñas (S, de 12-18KDa, codificadas por el gen o familia de genes rbcS). Las subunidades grandes forman un núcleo organizado como un tetrámero de dímeros (L2) 4 alrededor de un eje de simetría C4, y las subunidades pequeñas se sitúan en ambos polos de dicho eje, 4 en cada lado. La molécula está atravesada por un canal acuoso, que coincide con el eje C4.

Algunas bacterias fotosintéticas y dinoflagelados tienen Rubisco forma II, figura 1B, que consiste en un solo dímero de subunidades grandes L2, semejante, a grandes rasgos, a los dímeros que componen el núcleo central de la forma I.

La forma III, figura 1C de Rubisco se encuentra en algunas arquebacterias, entre las que se ha resuelto la estructura de Thermococcus kodakaraensis. El holoenzima está compuesto únicamente por subunidades grandes que se disponen en un decámero con simetría pentamérica (L2) donde las interfases entre dímeros son muy diferentes a las de la forma I.

La forma IV, figura 1D, es un término que se reserva a proteínas de secuencia homóloga a la Rubisco, que carecen de los residuos que componen el centro activo y que, consecuentemente, no poseen una actividad carboxilasa apreciable. Se encuentra en bacterias verdes sulfurosas y se les han asociado funciones en la respuesta a estrés oxidativo y en el metabolismo del azufre. No se conoce la estructura de ninguna de estas proteínas.

S

SDS/PAGE

SDS/PAGE

(Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico)

Técnica ampliamente usada en bioquímica, genética, biología molecular, que tiene como objetivo la separación de biomoléculas con base en su peso molecular bajo la acción de un campo eléctrico; es un método relativamente rápido, reproducible y de bajo costo.

Este procedimiento permite separar proteínas, haciéndolas pasar por una resina (Bis-Acrilamida), que se comporta como un agente entrecruzador que genera un polímero sobre el cual se adhieren las proteínas.

El SDS (dodecil sulfato sódico), es un detergente aniónico que se une a las proteínas, haciendo que estás tomen una forma lineal y adquieran carga uniforme, de tal manera que sólo pueden ser separadas según su tamaño, éste SDS, se encarga de desnaturalizar por completo las proteínas, rompiendo las interacciones no covalentes que determinan la estructura terciaria y cuaternaria. Los grupos alifáticos dodecil, se colocan en el interior, y los grupos sulfato en la superficie, de modo que todos los complejos SDS-proteína toman carga negativa.

Al aplicar un campo eléctrico a la muestra, que está inmersa en un tampón de carga que consiste en: mercapto-etanol (Me), dodecil sulfato sódico (SDS) y azul de bromofenol; el complejo proteína-SDS migra hacia el polo positivo y se separa según su tamaño, debido a la pérdida de la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas, de tal forma que se generan tantas cadenas polipeptídicas como posee la proteína.

Los polipéptidos de menor peso molecular migran más rápido, mientras que los de elevados pesos moleculares lo hacen más lentamente.

Finalmente las proteínas separadas en el gel (Bis-Acrilamida) pueden ser visualizadas mediante métodos de tinción, usando moléculas afines a las proteínas; el gel es típicamente teñido con azul de Coomassie.

Las aplicaciones más comunes de esta técnica son:

o Identificación de proteínas

o Identificación de enlaces disulfuro

o Cuantificación de proteínas

o Análisis del grado de pureza de una proteína

o Determinación de su peso molecular

o Verificación de la concentración de proteínas

o Detección de proteólisis

o Determinación de la distribución de proteínas entre fracciones

o Identificación de proteínas inmunoprecipitadas

o Separación de proteínas marcadas con isótopos radioactivos.

Sistema genético de λgt-11

El sistema λgt-11 es útil para la construcción de genotecas de ADNc y /o genómicas, al igual que para el aislamiento de proteínas de fusión a β-galactosidasa usando anticuerpos contra β-galactosidasa. El cromosoma del bacteriófago lambda es una molécula lineal de ADN de 48.6 Kb de longitud, con el 40% del genoma no esencial para la propagación del fago. Los ingenieros genéticos, al retirar estas partes e introducir otras, han construido una gama de vectores para diferentes propósitos de clonaje. Uno de estos es el vector de inserción y expresión lambda gt-11, un fago temperado que contiene el promotor Lac y el gen estructural Z para la β−galactosidasa, tomados a partir del operón Lac de E. coli.

Características generales del sistema Lambda gt-11:

o Genotipo: lac5, cI857, nin5, sam100.

o Capacidad de clonaje: 0 – 7.0 Kb.

o Sitio de clonaje: Eco RI.

o Promotor: P Lac.

o Reconocimiento de recombinantes: fenotipo Lac- sobre hospedero LacZ-.

o Reconocimiento de no recombinantes: fenotipo Lac+ sobre hospedero LacZ-.

o Propiedades de los fagos recombinantes: cI ts, Int+, red+.

o Mapa genómico de E. coli, mostrando la localización de los marcadores genéticos implicados en el funcionamiento del sistema lambda gt-11.

El sitio usado para la inserción del ADN blanco es un lugar único de clivaje Eco RI localizado dentro del gen Lac Z, 53 pb corriente arriba del codón de terminación de la transcripción de la β−galactosidasa. El clivaje de lambda gt-11 con Eco RI genera dos brazos de aproximadamente 19 y 24 Kb de longitud, los cuales flanquearán los ADN blancos para clonar.

T

Termolisina

es una enzima termoestable metaloproteinasa neutra producida por la bacteria gram-positiva Bacillus thermoproteolyticus. requiere de un ion zinc para la actividad enzimática y cuatro de calcio para la estabilidad estructural. cataliza especifica mente la hidrólisis de enlaces peptídicos que contienen aminoácidos hidrofóbicos. sin embargo ésta es ampliamente utilizada para la formación de enlaces peptídicos a través de la reacción inversa de la hidrólisis.

también es usada en la síntesis del aspartamo, un subproducto de un sabor menos amargo es producido cuando la reacción se lleva a cabo con termolisina

TRAP

TRP (Transportador periplasmatico independiente de ATP)

Familia de transportadores de solutos encontrados en Eubacteria y Archae, pero no en Eukarya.

Son especificos para la recepcion de acidos organicos (C4-dicarboxilatos: succinato, malato, fumarato; Keto-acids: piruvato y alpha-ketobutyrate; tambien incluye pyroglutamato, hidroxiectoina).

TRAP fue descubierto por David kelly Profesor en University of Sheffield, UK.

Tripsina

La tripsina es una proteasa que se sintetiza como precursor (tripsinogeno) en la parte exocrina del páncreas, se agrega y activa en el intestino delgado para degradar las proteínas de la alimentación en fragmentos “manejables”. La tripsina pertenece -igual que las enzimas pancreáticas relacionadas: la quimotripsina y la elastasa- a la clase de las serinproteasas, que deben su nombre al hecho de poseer una serina excepcionalmente reactiva en el centro activo. Como endopeptidasa, la tripsina cataliza la hidrólisis de los enlaces peptídicos que se encuentran en el interior de una proteína degradando ésta en oligopéptidos mas cortos que pueden ser fácilmente reabsorbidos por la mucosa intestinal.

La tripsina activa consta de una cadena polipeptídica de 224 aminoácidos de longitud que adopta la forma de una molécula globular con dos dominios ricos en lamina plegada B (figura 12.11a). En el punto de contacto de ambos domios, la superficie de la tripsina presenta una “muesca” que alberga el lugar de union del sustrato (figura 12.11b). Dentro de ella, la histidina-57, el aspartato-102 y la serina-195 forman la tríada catalítica del centro activo. El centro activo tiene dos funciones: unión del sustrato y catálisis de la ruptura. Como se aprecia en el modelo de cintas, ambos dominios de tripsina son necesarios para formar la tríada catalítica. La tripsina reacciona con especial sensibilidad a un aumento de temperatura superior a 37°C. La rotura de la estructura terciaria (desnaturalización) debida a un aumento de temperatura supone casi siempre la perdida de la conformación del centro activo y, con ello, la de la actividad enzimática. Esto se aplica a la mayoría de las enzimas.

La trpsina es una proteasa especifica de secuencia: rompe preferiblemente enlaces peptidicos que están procedidos por los aminoácidos básicos arginina o lisina. El aminoácido básico contiene el grupo carbonilo del enlace peptídico (que debe ser fragmentado). Sin embargo, los aminoácidos que poseen el grupo amino de este enlace peptídico no son específicos. La especificidad de sustrato de la tripsina, es decir, su preferencia por los restos de lisina y arginina, se explica por las particularidades estructurales de su bolsillo de unión.

Tritón X-100

El Tritón X-100 (C14H22O(C2H4O)n) es un surfactante no iónico el cual tiene un grupo óxido de polietileno hidrofílico (en promedio tiene 9,5 unidades de óxido etileno) y un hidrocarburo lipofílico o un grupo hidrofóbico.

Es comúnmente usado como detergente en los laboratorios. Entre sus aplicaciones se encuentran:

o Puede ser usado para permeabilizar membranas celulares eucarióticas no fijadas (o ligeramente fijadas).

o También se usa en la extracción de ADN como parte del buffer de lisis (usualmente en una solución buffer de lisis alcalina al 5%).

o Puede ser usado para reducir la tensión superficial de soluciones acuosas durante una inmunotinción (usualmente en una concentración de 0,1-0,5% en buffer TBS o PBS).

U

UREA

Urea

Densidad

1340 kg/m3; 1,34 g/cm3

Masa molar

60,06 g/mol

Punto de fusión

405.8 K (132.7 °C)

Acidez (pKa)

0.18

Solubilidad enagua

En agua:

108 g/100 ml (20 °C)

167 g/100 ml (40 °C)

251 g/100 ml (60 °C)

400 g/100 ml (80 °C)

733 g/100 ml (100 °C)

La urea es un compuesto químico cristalino bipolar e incoloro, de fórmula CO(NH2). Se encuentra abundantemente en la orina y en la materia fecal. Es el principal producto terminal del metabolismo de proteínas en el hombre y en los demás mamíferos. La orina humana contiene unos 20g por litro, y un adulto elimina de 25 a 39g diariamente.

En cantidades menores, está presente en la sangre, en el hígado, en la linfa y en los fluidos serosos, y también en los excrementosde los peces y muchos otros animales. También se encuentra en el corazón, en los pulmones, en los huesos y en los órganos reproductivos así como el semen. La urea se forma principalmente en el hígado como un producto final del metabolismo. Elnitrógeno de la urea, que constituye el 80% del nitrógeno en la orina, procede de la degradación de los diversos compuestos con nitrógeno, sobre todo de los aminoácidos de las proteínas en los alimentos. En los mamíferos la urea se forma en un ciclo metabólico denominado ciclo de la urea. La urea está presente también en los hongos así como en las hojas y semillas de numerosas legumbres y cereales.

Derivados.

Los derivados de la urea formados por sustitución de alguno de los hidrógenos se denominan de tres maneras:

o Como productos sustitutivos de la urea. Por ejemplo metilurea CH3NHCONH2

o Si el grupo de la urea es denominado como sustituyente de otro compuesto principal, se utiliza el prefijo ureido- para el grupo H2N-CO-NH-. Por ejemplo, el nombre IUPAC de la citrulina es Ácido 2-amino-5-ureidopentanoico:

o Otro nombre que puede adquirir el grupo H2N-CO-NH- es carbamilamino. En el caso de la citrulina, también se puede llamar como Ácido 2-amino-5-carbamilaminopentanoico

Si hay sustituyentes en ambos nitrógenos se pueden utilizar los locantes N y N' o 1 y 3, respectivamente.

Palabra(s) clave:

V

Vector

Los vectores moleculares son secuencias de ADN de diferente naturaleza, que pueden reproducirse autónomamente y en los cuales es posible introducir otras secuencias nucleotídicas. Deben ser de pequeñas dimensiones, deben poderse purificar fácilmente en gran cantidad y deben codificar una propiedad que puede ser usada para seleccionar las bacterias que han recibido el ADN a clonar. Ni la propiedad selectiva ni las funciones de reproducción deben ser inactivadas cuando el ADN extraño es introducido, el vector debe tener sitios únicos de ataque para diferentes encimas de restricción específicas, debe tener propiedades que permitan seleccionar moléculas de ADN recombinante y debe estar en grado de promover la expresión de las moléculas clonadas. Los vectores con estos requisitos han sido construidos desde los plásmidos y desde los fagos que se encuentran en la naturaleza.(Plásmidos, Bacteriófagos, Cósmidos)

Vector pBluescript II

El vector pBluescript II, es un fagémido, es decir, un plásmido originado a partir de un fago, no viral, con una longitud aproximada de 2961 pb, diseñado fundamentalmente para simplificar procedimientos de clonación y secuenciación, y usado ampliamente en procesos como: clonación de ADN, secuenciación de ADN didesoxi, mutagénesis específica del sitio, mapeo de genes, entre otros, estos fagémidos tienen un extenso polilinker con 21 sitios de restricción únicos de reconocimiento de enzimas.

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