Cromatografia Liquida
pinguineitor6 de Septiembre de 2013
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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatografía. En la HPLC socrática el compuesto pasa por la columna cromatografía a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser diluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.
La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con RMe2 SiCl .
La fase móvil actúa de portador de la muestra.
La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la muestra.
La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza de los compuestos a determinar.
1ÍNDICE
1.- Principio………………………………………………………………………………….
1.1 Tipos de HPLC…………………………………………………………………….
1.2 Cromatografía de fase normal…………………………………………………...
1.3 Cromatografía de fase reversa…………………………………………………..
1.4 Cromatografía de exclusión molecular………………………………………….
1.5 Cromatografía de intercambio iónico……………………………………………
1.6 Cromatografía basada en bioafinidad…………………………………………
1.7 Cromatografía líquida de alta eficacia en condiciones desnaturalizantes (DHPLC)………………………………………………………………………………..
2.- Parámetros………………………………………………………………………………
2.1 Diámetro interno…………………………………………………………………..
2.2 Medida de las partículas………………………………………………………….
2.3 Tamaño de poro…………………………………………………………………..
2.4 Presión del sistema……………………………………………………………….
3.- Fabricantes de aparatos de HPLC……………………………………………………
4.- Fabricantes de columnas de HPLC y accesorios……………………………………
1.0. CARACTERÍSTICAS Y EQUIPOS DISPONIBLES
1.0.1. Características más importantes…………………..
1.1. INSTRUMENTACIÓN PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
1.1.1. Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los
Disolventes…………………
1.1.2. Sistemas de bombeo………………………..
1.1.2.1. Tipos de bombas…………………………..
1.1.2.2. Amortiguadores de pulsos……………………………
1.1.2.3. Control del caudal y sistemas de programación……………………
1.1.3. Sistemas de inyección de muestra……………………..
1.1.4. Columnas para cromatografía de líquidos……………………….
1.1.4.1. Columnas analíticas……………………………………..
1.1.4.2. Pre columnas…………………………..
1.1.4.3. Termostatos……………………………….
1.1.4.4. Tipos de rellenos de la columna…………………………
1.1.5. Detectores…………………………………………….
1.1.5.1. Detectores de absorbancia………………………
1.1.5.2. Detectores de fluorescencia……………………
1.1.5.3. Detectores de índice de refracción…………………………
1.1.5.4. Detector de dispersión de luz…………………………………
1.1.5.5. Detectores electroquímicos…………………………………………………..
1.2. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA HPLC……………….
1.2.1. Cromatografía de reparto…………………………….
1.2.1.1. Columnas para cromatografía con fases unidas
Químicamente…………………………………..
1.2.1.2. Establecimiento del método en cromatografía de reparto….
1.2.1.3. Aplicaciones de la cromatografía de reparto……..
1.2.2. Cromatografía de adsorción……….
1.2.2.1. Selección del disolvente en cromatografía de adsorción…
1.2.2.2. Aplicaciones de la cromatografía de adsorción……….
1.2.3. Cromatografía iónica……..
1.2.3.1. Equilibrios de intercambio iónico……..
1.2.3.2. Rellenos de intercambio iónico……
1.2.3.3. Aplicaciones inorgánicas de la cromatografía iónica…
1.2.3.4. Aplicaciones orgánicas y bioquímicas………..
1.2.4. Cromatografía de exclusión por tamaños………..
1.2.4.1. Rellenos de columna…………
1.2.4.2. Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaños...
1.0. CARACTERÍSTICAS Y EQUIPOS DISPONIBLES
1.0.1. Características más importantes
Aplicaciones principales: Técnica de separación para los materiales menos volátiles e iónicos; análisis cuantitativo de multicomponentes.
Fenómeno molecular: Reparto entre una solución líquida y un substrato
Ventajas en el análisis cualitativo: Separa materiales para su examen por medio de otras técnicas.
Ventajas en el análisis cuantitativo: Aplicación amplia a los materiales menos volátiles, análisis de multicomponentes.
Muestra promedio deseable: 10 mg
Limitaciones del método: Se tarda en desarrollar el método
Limitaciones para la muestra: Ninguna.
INSTRUMENTACIÓN PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Con objeto de alcanzar un caudal de diluyente razonable con rellenos de tamaño de partícula entre 3 y 10 µm, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografía de líquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centímetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografía. La Figura 4.2 muestra un esquema de los componentes fundamentales de una cromatografía de líquidos de alta resolución típico. Cada uno de los componentes se trata en los párrafos que siguen a continuación.
1.1.1. Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los
Disolventes
Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o más recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 ml de un disolvente. Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos -en general oxígeno y nitrógeno- que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, un sistema de destilación, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o, como se muestra en la Figura 4.2, sistemas de difusión que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas también contienen un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en suspensión de los disolventes. No es necesario que los descalificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la Figura 4.2. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vacío a través de un filtro de poro muy pequeño. Este tratamiento elimina los gases además de la materia en suspensión.
Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se denomina una elución isocrática. Con frecuencia, la eficiencia de la separación se aumenta notablemente por una elución
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